廖世杰 李波香 馮文宇 劉云 羅愷 丁曉飛 趙勁民

[ 摘要] 目的 研究中藥單體鷹嘴豆芽素 A?對(duì)Perthes 病股骨頭畸形、對(duì)破骨細(xì)胞分化以及破骨細(xì)胞功能的影響，以找尋治療和預(yù)防該病的藥物。方法 建立股骨頭缺血性壞死動(dòng)物模型，鷹嘴豆芽素 A?干預(yù)后觀察股骨頭形態(tài)學(xué)改變。不同濃度鷹嘴豆芽素A 干預(yù) RANKL?誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，TRAP?染色后觀察破骨細(xì)胞數(shù)量改變，RT-PCR?檢測(cè) TRAP、MMP-9?水平。結(jié)果 鷹嘴豆芽素 A?可以緩解股骨頭缺血性壞死后畸形，抑制破骨細(xì)胞的形成以及標(biāo)志基因 TRAP、MMP-9?表達(dá)。結(jié)論 鷹嘴豆芽素 A 可以預(yù)防股骨頭缺血性壞死，是可預(yù)防股骨頭缺血性壞死后畸形的潛在藥物。

關(guān)鍵詞：鷹嘴豆芽素 A;兒童股骨頭缺血性壞死;破骨細(xì)胞;中藥單體

【中圖分類號(hào)】R816.8 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2019）05-010-03

股骨頭缺血性壞死（ischemic osteonecrosis of the femoral head ，ONFH）可發(fā)生于成人或兒童中，是由各種原因造成股骨頭缺血后發(fā)生的髖部疾患。Legg-Calvé-Perthes disease，簡(jiǎn)稱 Perthes 病，是發(fā)生于兒童的特發(fā)性股骨頭缺血性壞死 [1]。

股骨頭骨骺缺血壞死愈合后可遺留不同程度畸形，嚴(yán)重影響兒童的身心健康，是青年髖關(guān)節(jié)置換的主要原因之一 [2] 。

股骨頭缺血壞死后破骨細(xì)胞異常激活和隨之而來的局部骨溶解是股骨頭骨骺畸形愈合的重要原因 [3-5]。骨髓來源的造血祖細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的刺激下向壞死區(qū)遷移形成破骨細(xì)胞，執(zhí)行骨吸收功能。鷹嘴豆芽素 A?主要來源于鷹嘴豆芽素豆、紅車軸草全草，屬于黃酮類天然化合物。鷹嘴豆芽素有許多藥理特性，如：抗氧化、抗炎及抗腫瘤等 [6]。既往研究表明，鷹嘴豆芽素 A?可通過抑制破骨細(xì)胞的活化來改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。但兒童股骨頭缺血性壞死破骨細(xì)胞分化的機(jī)制與骨質(zhì)疏松癥不完全相同，本研究通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探究鷹嘴豆芽素A?對(duì)Perthes?病股骨頭骨骺畸形愈合的預(yù)防作用。 ??????????? ??????????????????????????????????????????????????1?材料與方法

1.1?動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)使用雄性 Sprague-Dawley?大鼠（8?周齡，廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，中國(guó)）。大鼠在 SPF?級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，可自由活動(dòng)、獲取食物和水。鷹嘴豆芽素 A（純度> 99% ， 購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司）， 溶于二甲基亞砜（Aladdin?試劑公司）。培養(yǎng)基 α-MEM?和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于 Gibco BRL。重組可溶性巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和重組小鼠可溶性 RANKL 購(gòu)于美國(guó)R&D公司。CCK-8 購(gòu)自Beyotime生物技術(shù)研究所。 TRAP染色試劑盒購(gòu)于Sigma-Aldrich。其他化學(xué)品購(gòu)自 Sigma 公司。

1.2?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

該實(shí)驗(yàn)得到廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。 12?只大鼠隨機(jī)分為 4?組：假手術(shù)組（Sham，n?= 6），骨壞死組（ON， n?= 6），鷹嘴豆芽素 A?治療的骨壞死組（ON?+ 鷹嘴豆芽素 A，n?= 6）。動(dòng)物模型的建立，采用經(jīng)典的股骨頸環(huán)扎法 [7，8]。簡(jiǎn)而言之，在麻醉后，在右側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子上方的皮膚上縱向切開皮膚，分離臀大肌和臀中肌以暴露關(guān)節(jié)囊。打開關(guān)節(jié)囊，用不可吸收線結(jié)扎股骨頸（# 3-0 Vicryl， Ethicon）。股骨頭復(fù)位后，逐層縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組僅解剖關(guān)節(jié)囊，不結(jié)扎股骨頸。手術(shù)后，鷹嘴豆芽素 A

組隔天腹腔注射鷹嘴豆芽素 A（ 5 mg / kg），持續(xù) 4 周。假手術(shù)組和骨壞死組予相同劑量的 PBS。術(shù)后 4 周對(duì)所有動(dòng)物實(shí)施安樂死。造模側(cè)股骨頭取材后用拍照觀察。

1.3?骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMMs）提取 ????????????????????????????????4?周齡大的 C57BL?小鼠用于提取造血祖細(xì)胞。對(duì)小鼠

實(shí)行安樂死后，分離出小鼠股骨和脛骨，剪刀剪去兩端骨骺后，使用裝滿完全培養(yǎng)基的注射器將骨髓細(xì)胞從骨髓腔內(nèi)沖出，即為骨髓造血祖細(xì)胞。 隨后將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至

T75 培養(yǎng)瓶中，并加入含有 MCSF（30ng/mL）、10% FBS 的 α-MEM 的培養(yǎng)液，細(xì)胞在 37℃的 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （ 下同 ）。即可得到 BMMs。

1.4?破骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

將 BMMs 從 T75 中消化下來后， 按 6×103 / 孔的密度轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，使用完全培養(yǎng)基（含有 MCSF30 ng/ mL、RANKL 100 ng/mL 和 10% FBS 的 α-MEM 的培養(yǎng)液 ， 下同） 進(jìn)行培養(yǎng)。 按鷹嘴豆芽素 A 濃度（0，2.5，5，10 和20μM）進(jìn)行分組，并設(shè)置不加 RANKL 的陰性對(duì)照組。按上述培養(yǎng)條件孵育細(xì)胞，隔天換液至 7 天，顯微鏡下觀

察出現(xiàn) 3 個(gè)核及以上巨噬細(xì)胞即判斷為破骨細(xì)胞。此時(shí)用PBS 清洗培養(yǎng)液并用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞。避光條件下使用TRAP 染色試劑盒染色15 分鐘。隨后下顯微鏡下拍照， 超過三個(gè)細(xì)胞核并且 TRAP 染色陽(yáng)性即為破骨細(xì)胞，記錄其數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)。

1.5?細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

使用 CCK-8 試劑盒來檢測(cè)不同濃度鷹嘴豆芽素 A 對(duì)BMMs 的細(xì)胞毒性作用。 按 6×103 細(xì)胞密度，使用完全α-MEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞種于 96 孔板中，按鷹嘴豆芽素濃度分組（0，2.5，5.0，10，20 和 40μM），每個(gè)分組有 3 個(gè)副孔。培養(yǎng) 48 小時(shí)后，按 CCK8 說明書要求，向每個(gè)孔中加入 10μL CCK-8 緩沖液，按要求培養(yǎng) 4 小時(shí)。 使用吸光度酶標(biāo)儀（Infinite M1000 PRO，Tecan）在 450nm 下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

1.6?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）

將上述 BMMs 按 1. 2×105 個(gè)細(xì)胞 / 每孔種入 6 孔板中， 用含 30 ng /mL M CSF 和 100 ng /mL RANKL 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，并用鷹嘴豆芽素 A（0，5，10 和 20μM） 干預(yù)。上述條件培養(yǎng)細(xì)胞，每 48 小時(shí)換液至第 5 天。當(dāng)顯微鏡下觀察到鷹嘴豆芽素 （ 0μM） 出現(xiàn)大而融合的破骨細(xì)胞時(shí)，即用Trizol 將細(xì)胞裂解，按相關(guān)操作說明提取總 RNA，再將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后，使用 Real - Time PCR 儀器檢測(cè) ACP5 （ TRAP ）、MMP9 基因的擴(kuò)增情況。序列。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。 用獨(dú)立樣本

t 檢驗(yàn)（對(duì)于兩組）或單向 ANOVA（對(duì)于兩組以上）分析數(shù)據(jù)。通過Pearson 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)間的相關(guān)分析。假設(shè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為 P < 0.05。 星號(hào)（*，** 和 ***）分別代表 P < 0.05，P < 0.01 和 P < 0.001。

2.1?鷹嘴豆芽素 A?可改善股骨頭缺血性壞死后股骨頭

畸形

股骨頭骨骺血供中斷是 Perthes 病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，我們采用經(jīng)典的股骨頸環(huán)扎法建立動(dòng)物模型。建模后 4 周， 與假手術(shù)組大鼠相比，骨壞死組大鼠股骨頭外觀呈明顯扁平狀畸形，股骨頭骨骺出現(xiàn)骨壞死（圖 1 A，B）。結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。與假手術(shù)組比較，鷹嘴豆芽素 A 治療組股骨頭骨骺稍扁平，但是畸形程度較缺血性骨壞死組大鼠輕（圖 1 A，B 和 C）。大體觀結(jié)果初步提示鷹嘴豆芽素

A 可改善股骨頭缺血性壞死后畸形。

2.2?鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細(xì)胞分化

目前研究表明，破骨細(xì)胞過度活化促進(jìn)了股骨頭壞死后畸形愈合，因此我們進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)：觀察鷹嘴豆芽素 A 對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。如圖 2-A?所示，陰性對(duì)照組中未看到 TRAP?陽(yáng)性破骨細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照組中清楚地觀察到大量 TRAP?陽(yáng)性破骨細(xì)胞，不同濃度的鷹嘴豆芽素 A?處理后破骨細(xì)胞的數(shù)量有明顯差異（圖 2-B）。我們對(duì)各個(gè)分組進(jìn)行破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，20μM?組破骨細(xì)胞數(shù)為98.68±6.642 /?孔，顯著低于10.00μM?組（147±4.509 /?孔）、

5.00μM?組（172±9.074 /?孔）、2.5μM?組（265±5.508/?孔） 和對(duì)照組（271.3±11.22/ 孔）（圖 2-A）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明， 組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 2?B）。因此，鷹嘴豆芽素

A 可抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，抑制程度與藥物濃度呈正相關(guān)。

2.3?鷹嘴豆芽素 A 對(duì)破骨細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性

為了排除是否鷹嘴豆芽素 A 對(duì)破骨細(xì)胞細(xì)胞毒性導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量減低，我們進(jìn)行了 CCK-8 試驗(yàn)。結(jié)果表明， 高濃度的藥物有顯著細(xì)胞毒性，但本研究中， 鷹嘴豆芽素

A?刺激 BMMs?48 小時(shí)后，使用的藥物濃度（0，2.5，5.0，10，

20?和 40μM）對(duì) BMMs?活性沒有顯著的細(xì)胞毒性作（圖 2

C）。 這些結(jié)果表明，鷹嘴豆芽素抑制破骨細(xì)胞分化時(shí)沒有明顯的細(xì)胞毒性。

2.4?鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄

破骨細(xì)胞分化過程中可表達(dá)一些標(biāo)志性基因，例如MMP-9， TRAP。TRAP?是破骨細(xì)胞分化的特異性基因，而MMP-9?在骨吸收是發(fā)揮重要作用。在該實(shí)驗(yàn)中，將 BMMs 分成 3?組：對(duì)照組，用 RANKL?誘導(dǎo)的 BMMs?和用 RANKL 誘導(dǎo)并用鷹嘴豆芽素A?處理的BMMs。鷹嘴豆芽素 A（5，10 和20μM）可以抑制RANKL?誘導(dǎo)的MMP-9，TRAP?的轉(zhuǎn)錄， 與對(duì)照組（鷹嘴豆芽素 A 0μM）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

骨壞死區(qū)破骨細(xì)胞過度活化及造成的骨溶解，是

Perthes 病股骨頭骨骺畸形愈合的主要原因。因此，抑制破骨細(xì)胞分化可作為預(yù)防股骨頭股骨頭骨骺畸形愈合的潛在非手術(shù)方法。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，鷹嘴豆芽素 A 治療組可改善股骨頭缺血性壞死后畸形。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鷹嘴豆芽素 A 可在無細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)抑制破骨細(xì)胞分化，可抑制破骨細(xì)胞分化特異性基因 TRAP 和MMP9 轉(zhuǎn)錄。因此，鷹嘴豆芽素 A 可作為改善股骨頭缺血性壞死后畸形的潛在天然活性藥物。

股骨頭缺血性壞死后病理改變促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化， 這些因素包括壞死物質(zhì)持續(xù)存在 [3，5]，髖關(guān)節(jié)滑膜液中

IL-6、IL-17?顯著升高 [4]。這些條件共同構(gòu)成了持續(xù)的骨壞死區(qū)慢性炎性改變。該環(huán)境下細(xì)胞因子可通過直接或間接途徑刺激 RANK、RANKL?表達(dá)而使得破骨細(xì)胞持續(xù)過度激活 [9]。其結(jié)果是造成股骨頭骨小梁過度吸收、力學(xué)強(qiáng)度下降和股骨頭骨骺塌陷，最終形成股骨頭扁平狀畸形 [10]。因此，抑制破骨細(xì)胞分化理論上可預(yù)防股骨頭骨骺畸形。

Kim?等 [11，12]?研究發(fā)現(xiàn)抑制 IL-6 表達(dá)或者競(jìng)爭(zhēng)性拮抗 IL-6 受體都可通過抑制破骨細(xì)胞分化緩解股骨頭畸形。直接使用 RANKL?受體單抗，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明具有治療 Perthes 病的效果 [13]。鷹嘴豆芽素 A 作為黃酮類化合物，可通過抑制破骨細(xì)胞的分化而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨量丟失。但其在股骨頭缺血性壞死中的作用也未得到研究。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，股骨頭壞死組股骨頭呈扁平狀畸形，有明顯的骨壞死。盡管較假手術(shù)組仍有畸形，但使用鷹嘴豆芽素 A?治療后，畸形程度可得到緩解。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明，在破骨細(xì)胞分化期間不同濃度的鷹嘴豆芽素 A?可降低

TRAP 染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞形成。而且這種效果呈濃度是呈濃度依賴的，CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明該藥物濃度下沒有細(xì)胞毒性。該結(jié)果和以往的研究結(jié)果類似。

破骨細(xì)胞分化過程中，RANKL 與其受體 RANK 結(jié)合后，可激活下游一系列信號(hào)通路，包括 MAPK 信號(hào)通路、NF-κB[14，15]。這些信號(hào)通路在破骨細(xì)胞分化的作用不同， 但是均可促進(jìn) c-FOS，NFATc1 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞內(nèi)特異性基因的表達(dá)，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯而發(fā)揮功能 [16]。TRAP 是破骨細(xì)胞分化中最特異性基因，其表達(dá)抗酒石酸酸性磷酸酶，該蛋白是破骨細(xì)胞分化的特異性蛋白。MMP-9 即金屬基質(zhì)蛋白酶 9，其屬于金屬基質(zhì)蛋白酶家族， 其在骨吸收中的作用是講解細(xì)胞外基質(zhì) [17]。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在抑制破骨細(xì)胞分化的濃度范圍內(nèi)，鷹嘴豆芽素

A 可抑制 TRAP、MMP-9 的表達(dá)，該結(jié)果進(jìn)一步解釋了鷹嘴豆芽素 A 抑制破骨細(xì)胞分化的機(jī)制。

鷹嘴豆芽素 A 可改善股骨頭缺血性壞死后畸形，其可能的機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞分化。因此，鷹嘴豆芽素 A 可作為一種潛在的藥物用于改善股骨頭缺血性壞死后畸形。

• Kuroyanagi G， Adapala NS， Yamaguchi R， et al. Interleukin-6 deletion stimulates revascularization and new bone formation following ischemic osteonecrosis in a murine model[J]. Bone， 2018， 116： 221-231.

1946-1954.

[ 基 金 項(xiàng) 目 ] ?廣 西 研 究 生 教 育 創(chuàng) 新 計(jì) 劃 項(xiàng) 目

（YCBZ2018035）， 廣 西 自 然 基 金 青 年 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目

（2018GXNSFBA281090）， 廣 西 醫(yī) 科 大 學(xué) 大 學(xué) 生 創(chuàng) 新課 題（201910598259）， 廣 西 自 然 科 學(xué) 基 金 面 上 項(xiàng) 目（2017GXNSFAA198305）

[ 作者簡(jiǎn)介] 廖世杰（1985-），男，廣西梧州人，在讀博士，?主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科、手外科及小兒骨科工作。

[ 通訊作者 ] 趙勁民，E-mail： zhaojinmin@126.com