李強 徐倩楠 廖仲愷 鄧慧鳴 許榮華

中圖分類號 R735.2；R361+.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0614-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.08

摘 要 目的：研究阿司匹林對人胃癌細胞SGC-7901、BGC-823生長和自噬的影響。方法：以SGC-7901、BGC-823細胞為研究對象，磷酸鹽緩沖液（PBS）為陰性對照組，作用時間為48 h，采用MTT法檢測1、2、4、6、8、10 mmol/L阿司匹林以及5 mmol/L阿司匹林單用和分別與2.5 μmol/L氯喹、2.5 μmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-MA）聯用對胃癌細胞存活率的影響；采用流式細胞術檢測2、5 mmol/L阿司匹林以及5 mmol/L阿司匹林單用和分別與2.5 μmol/L氯喹、2.5 μmol/L 3-MA聯用對胃癌細胞凋亡率和細胞周期分布的影響；采用Hoechst33258染色觀察5 mmol/L阿司匹林對胃癌細胞核形態(tài)學的影響；采用Transwell小室試驗檢測5 mmol/L阿司匹林對胃癌細胞遷移的影響；采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察5 mmol/L阿司匹林對胃癌細胞內自噬體形成的影響；采用Western blot 法檢測2、5 mmol/L阿司匹林對胃癌細胞內自噬標志物LC3-Ⅱ蛋白表達的影響。結果：與陰性對照組比較，阿司匹林能明顯抑制SGC-7901、BGC-823細胞的存活率，且呈濃度依賴性，但對SGC-7901、BGC-823細胞的凋亡率沒有明顯影響，能夠誘導細胞周期阻滯在G1期。與阿司匹林單用組比較，阿司匹林+氯喹和阿司匹林+3-MA作用后SGC-7901、BGC-823細胞存活率明顯升高，G1期細胞分布率明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與陰性對照組比較，阿司匹林作用后SGC-7901、BGC-823細胞均未見明顯的DNA裂解片段、凋亡小體以及碎塊狀的濃密亮藍色，遷移數量明顯減少（P<0.001），自噬體明顯增加，LC3-Ⅱ蛋白表達明顯增強（P<0.05）。結論：阿司匹林能夠顯著抑制胃癌細胞SGC-7901、BGC-823的生長，使其細胞周期停滯在G1期，其作用機制可能與激活細胞自噬有關。

關鍵詞 胃癌細胞；阿司匹林；細胞自噬；細胞周期分布；存活率；凋亡率

Effects of Aspirin on the Growth and Autophagy of Human Gastric Cancer Cells SGC-7901 and BGC-823

LI Qiang，XU Qiannan，LIAO Zhongkai，DENG Huiming，XU Ronghua（Dept. of Gastrointestinal Tumor Surgery， the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University， Haikou 570102， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of aspirin on the growth and autoghagy of human gastric cancer cells SGC-7901 and BGC-823. METHODS： SGC-7901 and BGC-823 cells were selected as research objects， with phosphate buffer （PBS） as negative control treated for 48 h， MTT assay was used to detect the effects of 1， 2， 4， 6， 8， 10 mmol/L aspirin， 5 mmol/L aspirin alone or combined with 2.5 μmol/L chloroquine， 2.5 μmol/L 3-methyladenine （3-MA） on survival rate of gastric cancer cells. Flow cytometry was used to detect the effects of 2 and 5 mmol/L aspirin， 5 mmol/L aspirin alone or combined with 2.5 μmol/L chloroquine and 2.5 μmol/L 3-MA on the apoptosis rate and cell cycle distribution of gastric cancer cells. Hoechst33258 staining was used to observe the effects of 5 mmol/L aspirin on morphology of gastric cancer cell nucleus； Transwell chamber test was adopted to detect the effects of 5 mmol/L aspirin on the migration of gastric cancer cell. Laser confocal scanning microscopy was used to observe the effects of 5 mmol/L aspirin on autophagy formation in gastric cancer cells. Western blot method was used to detect the effects of 2 and 5 mmol/L aspirin on the protein expression of autophagy markers LC3-Ⅱin gastric cancer cells. RESULTS： Compared with negative control group， aspirin could inhibit the survival rates of SGC-7901 and BGC-823 cells in dose-dependent manner， but had no significant effects on apoptosis rate of SGC-7901 and BGC-823 cells； SGC-7901 and BGC-823 cells were blocked in G1 phase. Compared with aspirin alone group， the survival rates of SGC-7901 and BGC-823 were increased significantly after treated with aspirin+chloroquine and aspirin+3-MA， while the distribution rate of SGC-7901 and BGC-823 cells at G1 phase were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Compared with negative control group， there were no obvious DNA fragmentation fragments， apoptotic bodies and fragments of dense bright blue， while the number of migration cells were decreased significantly in SGC-7901 and BGC-823 cells after treated with aspirin （P<0.001）； the number of autophagosome was increased significantly and the protein expression of LC3-Ⅱ was enhanced significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Aspirin can significantly inhibit the growth of SGC-7901 and BGC-823 cells， and arrest cell cycle in G1 phase， the mechanism of which may be associated with the activation of autophagy.

KEYWORDS Gastric cancer cell； Aspirin； Cell autophagy； Cell cycle distribution； Survival rate； Apoptosis rate

胃癌（Gastric cancer，GC）是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，據全球癌癥數據統計顯示，其在2012年就有約95萬的新發(fā)病率，約72萬患者死于胃癌[1]。根據全國腫瘤登記中心最新發(fā)布的《2015中國腫瘤登記年報》數據顯示，在我國，胃癌的發(fā)病率和病死率僅次于肺癌和肝癌，位于第三位，且發(fā)病率和病死率仍在繼續(xù)迅速上升[2]。另外，因胃癌的早期臨床癥狀不明顯，多數患者確診為胃癌時已為中晚期，屆時手術治療和放化療的療效也不理想[3-4]。由此可見，胃癌已經嚴重威脅人類健康，其防治工作已成為全社會亟待解決的重要課題。

阿司匹林（Aspirin），又名乙酰水楊酸，是常見的非甾體類抗炎藥（NSAID），主要作用為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，常用于治療感冒、頭痛、發(fā)熱和風濕類疾病，還可用于預防心血管疾病[5]。近年來有研究發(fā)現，阿司匹林除有上述經典藥理作用之外，在抗腫瘤方面也具有重要作用，且其安全性高于部分抗腫瘤藥物。據報道，規(guī)律服用阿司匹林可明顯提高結腸癌、乳腺癌、前列腺癌患者的存活率[6-9]。盡管多項研究表明，阿司匹林具有很強的抗腫瘤作用，但其抗腫瘤的機制目前還不十分明確。本課題以人胃癌細胞株SGC-7901和BGC-823為研究對象進行體外研究，探討阿司匹林對胃癌細胞生長的影響及其可能的作用機制，以期為阿司匹林的臨床使用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；SpectraMax plus384型全波長酶標儀（美國MD公司）；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；TDZ6B-WS型臺式低速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；ACCURI C6型流式細胞儀（美國BD公司）；ChemiDoc XRS+System型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；880型激光共聚焦顯微鏡（美國Zeiss公司）。

1.2 藥品與試劑

阿司匹林對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號 ：A800349，純度：99%）；自噬雙標腺病毒（mRFP- GFP-LC3，上海漢恒科技有限公司，滴度：1.26×1010 PFU/μL）；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）均購于美國Gibco公司；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，批號：064M4108V）和兔抗人LC3-Ⅱ（自噬標志物）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購于美國Sigma公司；MTT試劑盒（批號：022817170423）、細胞周期檢測試劑盒（批號：023017170612）、異硫氰酸熒光素標記膜聯蛋白Ⅴ （Annexin Ⅴ-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（批號：082917171212）、Hoechst33258細胞凋亡染色試劑盒（批號：021617170649）、增強化學發(fā)光（ECL） 試劑盒（批號：052417170622）均購于碧云天生物技術有限公司；氯喹（批號：S443002）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，批號：S276709）均購于美國Selleck公司；Transwell小室（美國Corning公司）；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 細胞

人胃癌細胞SGC-7901和BGC-823均購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞存活率

選取處于對數生長期的SGC-7901、BGC-823細胞，0.25%胰酶消化后，用10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮制成單細胞懸液，接種于96孔板，調整細胞密度為5×103個/100 μL，待細胞貼壁后，先將阿司匹林、氯喹、3-MA分別溶于二甲基亞砜（DMSO），再用磷酸鹽緩沖液（PBS）調整濃度制成阿司匹林溶液（1、2、4、6、8、10 mmol/L）、氯喹溶液（2.5 μmol/L）、3-MA溶液（2.5 μmol/L），以加入1、2、4、6、8、10 mmol/L阿司匹林以及5 mmol/L阿司匹林（阿司匹林單用組）、2.5 μmol/L氯喹（氯喹組）、2.5 μmol/L 3-MA（3-MA組）、5 mmol/L阿司匹林+2.5 μmol/L氯喹（阿司匹林+氯喹組）、5 mmol/L阿司匹林+2.5 μmol/L 3-MA（阿司匹林+3-MA組）進行處理為試驗組，同時設置以給藥同體積的PBS進行處理為陰性對照組，每組設5個復孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于終止培養(yǎng)前4 h加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)37 ℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，用SpectraMax plus384型全波長酶標儀在570 nm波長下測定吸光度（A），計算細胞存活率（試驗組A570/對照組A570×100%）。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期分布

2.2.1 細胞凋亡率 選取處于對數生長期的SGC- 7901、BGC-823細胞，分別按1×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后分別加入2、5 mmol/L阿司匹林（阿司匹林低、高濃度組）以及PBS（陰性對照組），每組3個復孔，作用48 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細胞，800 r/min離心3 min，棄上清，收集細胞，用PBS重懸細胞并計數。取1×105個重懸細胞，800 r/min離心3 min，棄上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結合液重懸細胞，再加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（PI），室溫避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.2.2 細胞周期分布 選取處于對數生長期的SGC- 7901、BGC-823細胞，分別按1×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后分別加入2、5 mmol/L阿司匹林（阿司匹林低、高濃度組，其中5 mmol/L時為阿司匹林單用組）、PBS（陰性對照組）、2.5 μmol/L氯喹（氯喹組）、2.5 μmol/L 3-MA（3-MA組）、5 mmol/L阿司匹林+2.5 μmol/L氯喹（阿司匹林+氯喹組）、5 mmol/L阿司匹林+2.5 μmol/L 3-MA（阿司匹林+3-MA組），每組3個復孔，作用48 h后，收集細胞制成單細胞懸液，離心去上清后，逐滴加入70%的冰乙醇固定過夜，4 ℃保存，PBS洗去固定液，加入核糖核酸酶A（RNaseA）及PI染色，4 ℃避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

2.3 Hoechst33258染色檢測細胞核形態(tài)學變化

取干凈無菌的蓋玻片置于6孔板內，分別按1×105個/孔接種對數期生長的SGC-7901、BGC-823細胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至玻片表面細胞貼壁生長達50%～60%時，分別加入5 mmol/L阿司匹林（阿司匹林組）以及PBS（陰性對照組），每組3個復孔，作用48 h后，加入70%乙醇室溫固定15 min，去除固定液，PBS洗3次，進行Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)學變化。

2.4 Transwell小室試驗檢測細胞的遷移

用0.25%胰蛋白酶消化并收集對數生長期的SGC-7901、BGC-823細胞，PBS洗2次，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為5×105 mL-1。均勻加入200 μL細胞懸液至上室中，再分別加入濃度為5 mmol/L的阿司匹林（阿司匹林組）和PBS處理（陰性對照組）；下室加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，每組3個復孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出上室，用棉簽擦去上室細胞，PBS 漂洗后用多聚甲醛固定15 min，棄固定液，0.1%結晶紫染液染色10 min，PBS洗3次，每次10 min，顯微鏡下攝片，每組隨機挑選5個視野進行計數，取平均值。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內自噬體的形成

取干凈無菌的蓋玻片置于6孔板內，分別按1×105個/孔接種對數生長期的SGC-7901、BGC-823細胞，用mRGFP-GFP-LC3腺病毒感染（感染復數=300）胃癌細胞24 h后，加入5 mmol/L阿司匹林（阿司匹林組）和PBS（陰性對照組），作用48 h，4%多聚甲醛固定20 min，洗滌后加入含DAPI的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察胞內自噬體的形成情況。

2.6 Western blot法檢測細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達

選取處于對數生長期的SGC-7901、BGC-823細胞，分別按5×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，分別加入2、5 mmol/L阿司匹林（阿司匹林低、高濃度組）以及PBS（陰性對照組），每組3個復孔，作用48 h后收集細胞，提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，加入5×十二烷基硫酸鈉（SDS）加樣緩沖液混合，95%變性10 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，按1 ∶ 1 000加入兔抗人LC3-Ⅱ、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后，按1 ∶ 2 000 加入山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，洗膜，采用ECL試劑盒曝光，Quantity one圖像分析軟件分析目的條帶與內參（β-actin）條帶吸光度的比值，評價LC3-Ⅱ的相對表達量。

2.7 統計學方法

所有數據應用SPSS 19.0 統計軟件進行分析，計量數據以x±s表示，組間分析采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞存活率

3.1.1 阿司匹林單用 與陰性對照組比較，阿司匹林對SGC-7901、BGC-823細胞存活率均有明顯的抑制作用，且隨阿司匹林濃度的增加細胞存活率逐漸降低，呈濃度依賴性。阿司匹林對胃癌細胞存活率的影響見表1。

3.1.2 阿司匹林與氯喹、3-MA聯用 與阿司匹林單用組比較，阿司匹林+氯喹組和阿司匹林+3-MA組SGC-7901、BGC-823細胞存活率明顯升高（P<0.05或P<0.01），表明氯喹、3-MA能夠逆轉阿司匹林對SGC-7901、BGC-823細胞的抑制作用，進一步說明阿司匹林可能通過激活SGC-7901、BGC-823細胞自噬從而發(fā)揮抑制作用。阿司匹林聯合氯喹、3-MA對胃癌細胞存活率的影響見圖1。

3.2 細胞凋亡率與細胞周期變化

3.2.1 細胞凋亡率 阿司匹林對胃癌細胞凋亡率的影響見圖2。

由圖2顯示，阿司匹林對SGC-7901、BGC-823細胞的凋亡率無明顯影響。

3.2.2 細胞周期 與陰性對照組比較，2、5 mmol/L阿司匹林作用SGC-7901、BGC-823細胞48 h后，G1期細胞比例均明顯增加（P<0.05或P<0.01），說明阿司匹林能顯著誘導SGC-7901、BGC-823細胞阻滯在G1期。阿司匹林對胃癌細胞周期分布影響的流式圖見圖3，統計結果見圖4。

與阿司匹林單用組比較，阿司匹林+氯喹組和阿司匹林+3-MA組SGC-7901、BGC-823細胞G1期的細胞比例明顯降低（P<0.05或P<0.01），表明氯喹、3-MA能夠明顯降低阿司匹林對SGC-7901、BGC-823細胞G1期的阻滯作用，進一步表明阿司匹林可能通過激活自噬導致胃癌細胞阻滯在G1期從而發(fā)揮抑制作用。阿司匹林聯合氯喹、3-MA對胃癌細胞G1期細胞分布的影響見圖5。

3.3 細胞核形態(tài)學變化

鏡下可見，阿司匹林組SGC-7901、BGC-823細胞核發(fā)出均勻的藍光，細胞核完整，細胞核內的DNA未被酶裂解片段化，未見凋亡小體，未見碎塊狀的濃密亮藍色，但可見染色細胞核少于陰性對照組。阿司匹林對胃癌細胞核形態(tài)的影響見圖6。

3.4 細胞遷移

與陰性對照組比較，阿司匹林組SGC-7901、BGC-823細胞的遷移數量明顯減少（P<0.001），表明阿司匹林能明顯抑制SGC-7901、BGC-823細胞的遷移能力。阿司匹林對胃癌細胞遷移影響的顯微鏡圖見圖7，統計結果見圖8。

3.5 細胞內自噬體變化

與陰性對照組比較，阿司匹林組SGC-7901、BGC-823細胞中自噬體明顯增加，其中BGC-823細胞表現更為明顯，提示阿司匹林能夠促進SGC-7901、BGC-823細胞自噬體的形成。阿司匹林對胃癌細胞內自噬體的影響見圖9（圖中GFP-綠色熒光蛋白；GFP-紅色熒光蛋白；Merge-綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白合并）。

3.6 LC3-Ⅱ蛋白表達變化

陰性對照組和阿司匹林低、高濃度組SGC-7901細胞中LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量分別為1.07±0.10、1.27±0.18、1.43±0.10；BGC-823細胞中LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量分別為0.35±0.08、0.46±0.10、1.10±0.16。與陰性對照組比較，阿司匹林低、高濃度組SGC-7901、BGC-823細胞中LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量均明顯增強（P<0.05）。阿司匹林對胃癌細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達影響的電泳圖見圖10，統計結果見圖11。

4 討論

化學藥物治療是腫瘤治療的重要方法之一，目前臨床常用的抗腫瘤藥物普遍存在副作用大、毒性強、價格昂貴等短板，而新抗腫瘤藥物的研發(fā)耗時長、投入大，因此老藥新用的研究也是尋找抗腫瘤藥物治療的新途徑。據Lancet雜志報道，每天服用75～300 mg阿司匹林能夠在3年內將癌癥的發(fā)病率減少1/4，在5年內將癌癥相關的病死率降低15%[10]。在2017年NCCN結腸癌治療指南中，也建議將阿司匹林作為一級預防用藥[11]。雖然如此，但很多地區(qū)仍然未提出將阿司匹林作為癌癥預防用藥，主要原因是阿司匹林的作用機制尚不明確，仍處于研究階段；怎么減少其副作用的發(fā)生以及找出其安全有效的確切治療劑量是目前面臨的問題。本研究首先采用MTT法和Transwell小室試驗證實了阿司匹林能夠抑制胃癌細胞的生長和降低細胞的遷移能力。流式細胞術檢測細胞周期結果表明，阿司匹林能夠顯著誘導細胞周期阻滯在G1期。但流式細胞術檢測細胞凋亡和Hoechst33258染色結果都表明阿司匹林在48 h內不能誘導細胞凋亡，其可能機制還需進一步研究。

已有研究表明，阿司匹林的抗腫瘤作用機制有以下幾個：（1）選擇性地抑制環(huán)氧化酶2（COX-2）的表達，從而導致胃蛋白酶原（PG）的合成受阻，抑制腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管的生成以及侵襲或轉移[12]；（2）阿司匹林可上調B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）相關X蛋白Bax基因的表達并抑制Bcl-2基因的表達[13]。本研究還發(fā)現，阿司匹林可激活自噬抑制腫瘤的生長，誘導細胞周期抑制。氯喹可抑制自噬體與溶酶體融合，3-MA能抑制自噬小體的形成，因此自噬抑制劑氯喹和3-MA常用來探討自噬流的發(fā)生[14]。本研究中筆者利用阿司匹林聯合氯喹和3-MA共同處理胃癌細胞后發(fā)現，氯喹和3-MA能明顯逆轉阿司匹林對胃癌細胞G1期的阻滯作用。另外，LC3-Ⅰ是LC3-Ⅱ的前體，自噬形成時，胞漿型LC3-Ⅰ會酶解掉一小段多肽轉變?yōu)長C3-Ⅱ，所以LC3-Ⅱ蛋白定位于前自噬體和自噬體，隨自噬體膜的增多而增加，故LC3-Ⅱ常作為自噬的標志物[15]。筆者利用mRFP-GFP-LC3 標記及追蹤 LC3，發(fā)現當自噬激活時，溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，在激光共聚焦掃描顯微鏡可出現黃色斑點[16]。本研究結果表明，與陰性對照組比較，胃癌細胞經阿司匹林處理后自噬明顯增強。Western blot法也證實阿司匹林組LC3-Ⅱ 蛋白的表達水平比陰性對照組明顯增加，這與前人報道的阿司匹林能夠激活結腸癌細胞和肝癌細胞自噬從而抑制細胞生長的結果一致[17-18]。

為進一步探討阿司匹林誘導胃癌細胞周期阻滯是否與其激活自噬有關，筆者利用阿司匹林聯合氯喹和3-MA共同處理胃癌細胞，結果顯示，與阿司匹林單用比較，氯喹、3-MA能夠減少阿司匹林對胃癌細胞G1期的阻滯作用，提示阿司匹林通過激活自噬導致胃癌細胞G1期阻滯從而發(fā)揮抑制胃癌細胞生長的作用。近年來有多項研究表明，腫瘤細胞自噬與Akt/mTOR信號通路有著密切關系[19-20]。因此以后的研究工作將探討阿司匹林激活自噬致使細胞周期阻滯在G1期的作用機制是否與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路活性有關，以進一步闡明其分子作用機制，為阿司匹林的臨床應用提供依據。

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（收稿日期：2018-09-16 修回日期：2019-01-17）

（編輯：鄒麗娟）