林裕勝 江錦秀 張靖鵬 游偉 胡奇林

摘 要：【目的】建立一種快速簡便檢測綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae， Mo）的方法?！痉椒ā扛鶕?jù)Mo膜蛋白P80基因序列，利用Oligo 7軟件設(shè)計并篩選出特異性擴增引物，通過條件優(yōu)化建立檢測Mo的RPA方法?！窘Y(jié)果】該方法可特異性擴增Mo，對其他羊常見病原無特異性擴增，對Mo核酸的檢測靈敏度為70 fg·μL-1，與常規(guī)PCR敏感性一致。批內(nèi)和批間結(jié)果顯示Mo陽性樣品均能擴增條帶，而陰性對照均無擴增，表明重復性好。對186份臨床樣品應(yīng)用建立的RPA方法和常規(guī)PCR方法同時進行檢測，并對其中40份肺臟樣品進行支原體的分離鑒定，結(jié)果顯示分離鑒定出的13份Mo陽性樣品及常規(guī)PCR法檢測出的95份陽性樣品經(jīng)RPA檢測，結(jié)果均為陽性?！窘Y(jié)論】建立的Mo RPA方法特異性強、重復性好，可作為Mo的快速檢測和流行病學調(diào)查的一項候選技術(shù)。

關(guān)鍵詞：綿羊肺炎支原體;重組聚合酶擴增;等溫擴增

中圖分類號：S 852.62文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）04-416-06

Abstract： 【Objective】 To develop a rapid detecting method for? Mycoplasma ovipneumoniae （Mo）. 【Method】 Based on the P80 gene sequence， specific primers were designed using Oligo 7 software. Conditions of the recombinase polymerase amplification （RPA） method were optimized for the application. 【Result】 The new assay detected P80 gene in Mo specifically， not any other common pathogens of sheep and goats. The detection sensitivity was 70 fg·μL-1， which was the same as provided by conventional PCR. The inter- and intra-batch tests showed that the modified method could amplify the bands on Mo-positive samples， not on Mo-negative specimens， indicating an acceptable repeatability of the methodology. Furthermore， the RPA assay and conventional PCR methods were simultaneously used on 186 clinic samples， as well as the Mycoplasma isolation and identification on 40 lung samples， to show that the RPA assay positively identified all 13 Mo-positive samples detected by Mycoplasma isolation and identification and 95 positive samples detected by the conventional PCR. 【Conclusion】The newly developed RPA method had desirable specificity and repeatability on Mo detection. It could be applied for rapid detecting and epidemiological studies on Mo.

Key words： Mycoplasma ovipneumoniae; recombinase polymerase amplification; isothermal amplification

0 引言

【研究意義】綿羊肺炎支原體Mycoplasma ovipneumoniae，Mo屬于軟膜體綱Mollicutes，支原體目Mycoplasmatales，支原體科Mycoplasmaceae，支原體屬Mycoplasma，已被確認為引起綿羊和山羊支原體性肺炎（Mycoplasma pneumonia of goats and sheep，MPGS）的主要病原之一[1-4]。Mo的臨床癥狀表現(xiàn)為氣喘、高熱、咳嗽、漸進性消瘦和肺間質(zhì)增生性炎癥[5-7]，該病發(fā)病率為20%～30%，在急性發(fā)病過程中，病死率可達30%～50% [8-9]。近年來，隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，該病在國內(nèi)各省市均有流行發(fā)生的報道，給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，已成為制約養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一[10-12]。因此，建立一種快速簡便的檢測技術(shù)對于該病的防控與及時治療具有重要意義。

【前人研究進展】PCR技術(shù)在檢測病原體的方法中，被認為優(yōu)于分離培養(yǎng)法、免疫熒光檢測法和ELISA法等，以其能夠檢測微量的病原DNA而被作為診斷多種疫病的常用方法[13]。然而PCR反應(yīng)需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備，很多基層單位不具備檢測條件。重組聚合酶擴增 （Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術(shù) （英國公司TwistDxInc研發(fā)）主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，模擬生物體內(nèi)DNA復制，在常溫反應(yīng)0.5 h左右即可完成對目的片段的擴增，操作簡單，尤其適用于基層使用[14]。目前，RPA技術(shù)已經(jīng)在病毒、支原體、衣原體、細菌、寄生蟲等病原檢測方面得到了廣泛開發(fā)與應(yīng)用，如口蹄疫病毒[15]、非洲豬瘟[16]、山羊支原體山羊亞種[17]、動物衣原體[18]、結(jié)核分枝桿菌[19]、瘧原蟲[20]等?！颈狙芯壳腥朦c】迄今為止，尚未見RPA技術(shù)應(yīng)用于Mo的檢測。P80基因編碼的膜蛋白在免疫特性方面雖未有深入研究，但已應(yīng)用于遺傳進化樹分析，且以該基因為靶基因建立的診斷方法已有常規(guī)PCR和熒光定量PCR方法[9，21]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究根據(jù)Mo膜蛋白P80基因序列，利用Oligo 7軟件設(shè)計并篩選出特異性的擴增引物，建立Mo快速簡便的檢測方法，為基層工作者在Mo臨床樣品的快速檢測和流行病學調(diào)查提供一種新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株及臨床樣品

山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolum subsp. capripenumoniae，Mccp）F38株、綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipenumoniae，Mo）Y98株、山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolum subsp.capricolum，Mcc）Califormia Kid株由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所儲岳峰研究員饋贈。絲狀支原體絲狀亞種LC型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC，Mmm LC）Y-goat株、無乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）PG2株由西南民族大學湯承教授饋贈。牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）、大腸桿菌（Escherichia coli，Ec）、精氨酸支原體（Mycoplasma arginine，M.arginini）、溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，Mh）、巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、萊氏無膽甾原體（Acholeplasma laidlawii，AL）、Mo FJ-CL01株、Mo FJ-ND株、羊口瘡病毒 （orf virus，ORFV）及絲狀支原體山羊亞種（Mycoplasma mycoides subsp. capri，Mmc）為福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。186份臨床樣品來自于2016-2018年福建省福州市、寧德市、泉州市、南平市、三明市和莆田市，均為臨床上疑似羊支原體性肺炎病羊的肺組織和鼻拭子，發(fā)病羊表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、流鼻涕，剖檢見胸膜肺炎。

1.2 主要試劑

組織/細菌DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司;Nanodrop 2000購自賽默飛 （美國）公司;Twist AmpBasic試劑盒購自TwistDx （英國）公司;膠回收試劑盒購自康寧生命科學 （吳江）有限公司; Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 、DL1000 Marker均購自寶生物工程 （大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計合成

參照RPA引物設(shè)計原則，下載GenBank中登錄號為KM435069.1的Mo P80基因序列，利用Oligo 7.9軟件設(shè)計引物，通過BLAST在線軟件比對分析，初步驗證其特異性。Mo RPA引物的核苷酸序列為： P1： 5′- CTT AAT GAT GAG CGT AGT AGA TAC CAA ACCAC-3′/P2：5′- GCT GAG GTC GGA TTT GGA CTA ACA ATA TTT G-3′。擴增片段大小為353 bp。常規(guī)PCR引物參照林裕勝等[22]的方法，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 支原體和細菌核酸抽提

利用組織/細菌DNA提取試劑盒說明書分別提取供試支原體和細菌的DNA，用作RPA和PCR反應(yīng)的模板。

1.5 RPA的反應(yīng)條件及優(yōu)化

參照Twist? Amp Basic試劑盒說明書提供的RPA擴增反應(yīng)體系：取1 μL Mo Y98 DNA作為模板，10 μmol·μL-1上游引物和10 μmol·μL-1下游引物各2.4 μL、Rehydration Buffer 29.5 μL、無核酸酶純水 12.2 μL和280 mmol·μL-1醋酸鎂2.5 μL，總反應(yīng)體積為50 μL，同時以無菌去離子水作為空白對照，并以試劑盒提供的引物和模板作為陽性對照，用以監(jiān)控擴增反應(yīng)是否正常。采用矩陣法，優(yōu)化反應(yīng)溫度（36、38、40、42℃）和反應(yīng)時間（20、25、30、35、40 min）。擴增產(chǎn)物純化后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增目的片段由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6 Mo常規(guī)PCR及分離鑒定

常規(guī)PCR反應(yīng)體系為：Premix TaqTMVersion 2.0 plus dye 10 μL、上下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL、Mo DNA 2 μL、無菌去離子水補足至20 μL。反應(yīng)條件：94℃ 2 min;94℃ 30 s、58.5℃ 15 s、72℃ 15 s，30個循環(huán);72℃ 10 min。Mo分離鑒定法參照江錦秀等[23]的方法進行。

1.7 特異性試驗

分別以Mo Y98株以及FJ-CL01和FJ-ND株的DNA、Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、Mmm LC 、AL、Ec、SA、Pm的核酸作為模板，采用建立的Mo RPA方法進行檢測，同時設(shè)置空白對照，反應(yīng)結(jié)束后，利用PCR純化試劑盒回收擴增產(chǎn)物，然后經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測。RPA擴增反應(yīng)的加樣順序和反應(yīng)條件為：首先將RPA反應(yīng)體系中除了醋酸鎂之外的成分加入到Twist Amp Basic試劑盒提供的凍干酶復合物反應(yīng)管中，然后將醋酸鎂加入到反應(yīng)管蓋子內(nèi)，蓋上蓋子瞬時離心，使醋酸鎂進入反應(yīng)體系中，然后將反應(yīng)管放入38℃恒溫水浴鍋中孵育30 min。

1.8 敏感性試驗

利用Nanodrop 2000測定提取的Mo DNA濃度，將其10倍倍比稀釋（101～1010），分別以稀釋后的不同濃度的DNA為模板進行RPA反應(yīng)，以確定該引物的靈敏度，同時進行常規(guī)PCR檢測，比較兩者之間的敏感性。RPA反應(yīng)體系和條件同特異性試驗。

1.9 重復性試驗

利用建立的Mo RPA方法對2份Mo陽性樣品、Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、Mmm LC 、AL、Ec、SA、Pm各1份作陰性對照，反應(yīng)條件和體系參照特異性試驗。進行批內(nèi)重復試驗時，上述樣品均設(shè)3個重復;進行批間重復試驗時，上述樣品間隔3 d檢測1次，共測定3次。

1.10 臨床樣品檢測

利用建立的RPA方法對186份臨床樣品進行檢測，同時進行PCR檢測，并對其中40份肺臟樣品進行支原體的分離鑒定，根據(jù)檢測結(jié)果計算檢出率及符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化及擴增產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)優(yōu)化后，50 μL反應(yīng)體系最佳反應(yīng)時間和溫度為38℃反應(yīng)30 min。應(yīng)用優(yōu)化后的體系對Mo Y98株進行擴增并對擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示，Mo Y98經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴增出一條約350 bp的目的片段，與預期大小一致（圖1）。測序結(jié)果顯示， RPA擴增的Mo P80基因序列長度為353 bp，與參考的KM435069.1株序列同源性為99.8%，與預期結(jié)果相符。

2.2 特異性擴增

利用建立的RPA檢測方法對相應(yīng)細菌的核酸進行檢測，同時設(shè)置空白對照。結(jié)果顯示，僅 MoY98株以及本研究室分離株FJ-CL01和FJ-ND株的DNA擴增出與預期大小相符的目的條帶，而Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、Mmm LC、AL、Ec、SA、Pm和去離子水樣品均為陰性（圖2），表明建立的RPA方法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗

經(jīng)測定， Mo核酸質(zhì)量濃度為70 ng·μL-1，以10倍系列稀釋成7 ng·μL-1、700 pg·μL-1、70 pg·μL-1、7 pg·μL-1、700 fg·μL-1、70 fg·μL-1、7 fg·μL-1、700 ag·μL-1、70 ag·μL-1 進行RPA和常規(guī)PCR敏感性試驗，結(jié)果顯示：建立的Mo RPA方法與常規(guī)PCR方法的檢測限均為70 fg·μL-1，表明RPA與常規(guī)PCR方法的敏感性一致（圖3）。

2.4 重復性試驗

利用建立的Mo RPA方法對2份Mo陽性樣品，Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、Mmm LC 、AL、Ec、SA、Pm各1份作陰性對照進行批內(nèi)重復和批間重復試驗，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間試驗結(jié)果均一致（圖略），即除了2份Mo陽性樣品有擴增條帶，其余樣品均無擴增條帶，表明重復性好。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

利用建立的RPA方法對186份臨床樣品進行檢測，同時進行PCR檢測，并對其中40份肺臟樣品進行支原體的分離鑒定。結(jié)果顯示（表1），RPA方法Mo陽性率為51.1%（95/186），PCR方法檢測Mo陽性率為51.1%（95/186），同時，分離鑒定法的13份Mo陽性樣品及常規(guī)PCR法檢測出的95份陽性樣品經(jīng)RPA檢測，結(jié)果均為陽性，表明建立的RPA方法與常規(guī)PCR方法的符合率為100%，可作為臨床樣品中Mo快速檢測的候選技術(shù)。

3 討論與結(jié)論

RPA是近年來新興起來的一種常溫擴增技術(shù)，該技術(shù)的檢測原理是在目的DNA片段擴增過程中，重組酶與引物結(jié)合形成的復合物與DNA結(jié)合，并沿著DNA鏈尋找引物的同源序列，一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成[24]。同傳統(tǒng)的PCR方法相比，該技術(shù)具有如下優(yōu)點：首先是試劑使用方便，方便保存;其次是反應(yīng)時間短，反應(yīng)過程一般在40 min內(nèi);最后是對設(shè)備要求低，僅需一臺水浴鍋即可完成反應(yīng)，無需高昂儀器設(shè)備。由于該項技術(shù)的這些優(yōu)點，有利于基層單位以及邊遠山區(qū)的推廣應(yīng)用。因此本研究建立了一種以Basic RPA為基礎(chǔ)的快速檢測Mo的方法。

任何一種的檢測技術(shù)，都存在優(yōu)缺點。RPA方法作為一種新型的檢測技術(shù)，也存在一定的不足，比如引物的設(shè)計就沒有專門的軟件，而且RPA引物相比于常規(guī)PCR或熒光定量PCR引物要長10～20個堿基，還不能出現(xiàn)連續(xù)重復序列以及發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且GC含量要控制在30%～70%[25]。由于支原體基因組GC含量偏低，加上RPA引物設(shè)計具有以上不足，這就給本研究引物設(shè)計造成困難，然而本研究團隊在前期建立Mo實時熒光定量PCR、多重PCR的過程中，找到了符合RPA引物設(shè)計特性的基因P80，利用Oligo7.9軟件針對P80保守性序列設(shè)計多對引物，隨后通過實驗驗證以及體系優(yōu)化篩選到1對效果較好的引物。反應(yīng)條件優(yōu)化方面，由于RPA反應(yīng)體系已經(jīng)是比較成熟的，因此本研究僅對反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件為38℃孵育30 min。特異性驗證方面，本研究建立的Mo RPA檢測方法對Mcc、M.arginini、M.bovis、M.agalactiae、Mh、ORFV、Mccp、Mmc、Mmm LC 、AL、Ec、SA、Pm等均無交叉反應(yīng)，表明建立的RPA方法特異性強。靈敏度檢測結(jié)果顯示，建立的Mo RPA檢測方法的最低檢測限為70 fg·μL-1，與常規(guī)PCR結(jié)果一致，然而本研究建立的方法在靈敏度方面與國內(nèi)外研究報道還是有一定的差距，如劉占旭等[26]建立的豬嵴病毒RPA診斷方法最低檢測限達到了3.36×102 copies·μL-1，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍;Wang等[27]建立的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的qRPA方法最低檢測限達到了100 copies·μL-1，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍;Yang等[28]建立的羊口瘡病毒qRPA方法最低檢測限為100 copies·μL-1，樊曉旭等[29]建立的塞尼卡病毒RPA-LFD檢測方法最低檢限為56 copies·μL-1。本研究RAP方法敏感性較低的原因可能是由于Mo基因組GC含量偏低，導致擴增效率低下;此外引物長度過長，也可能是影響敏感性較低的一個原因。重復性驗證結(jié)果顯示，本研究建立的RPA方法可重復性較好。

因此，本研究成功建立了一種具有特異性強、重復性好、操作簡便的Mo RPA臨床快速檢測方法，為Mo的臨床快速檢測和流行病學調(diào)查提供了新的手段。

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（責任編輯：張 梅）