吳華莉 涂尾龍 曹建國 張鶯鶯 王洪洋 談永松

摘要：【目的】明確豬殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）基因中可能存在的SNP位點，并探討B(tài)PI基因外顯子10在上海地區(qū)5個豬群體中的多態(tài)性及其與抗病相關(guān)的優(yōu)勢基因型，為揭示BPI基因在仔豬腹瀉抗病機制中的作用及開展豬抗病育種提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎迷诰€生物信息學(xué)軟件分別從堿基序列、SNP位點和蛋白氨基酸序列等角度比對分析豬BPI基因全長cDNA序列與電子克隆序列的差異，采用PCR-RFLP檢測分析豬BPI基因外顯子10的多態(tài)性，并檢測BPI基因外顯子10在杜洛克、長白、大白、申農(nóng)和梅山豬群體中的基因型及基因頻率?！窘Y(jié)果】豬BPI基因電子克隆編碼區(qū)（CDS）序列長度1452 bp，編碼483個氨基酸，存在44個SNP位點，其中22個為同義SNP位點、22個為非同義SNP位點。豬BPI基因全長cDNA序列（EF436278.1和FJ810853.1）與電子克隆序列相比存在14處堿基差異，而對應(yīng)的翻譯蛋白序列存在4處氨基酸差異。豬BPI基因外顯子10存在AA、BB和AB 3種基因型，各基因型在杜洛克豬、長白豬、大白豬、申農(nóng)豬和梅山豬群體中的分布情況各不相同。在杜洛克豬群體中AA基因型和AB基因型呈中度多態(tài)分布（0.404和0.416），BB基因型檢出比例較低（0.180）;在長白豬和申農(nóng)豬群體中均未檢測出AA基因型，BB基因型檢出比例較高，而AB基因型檢出比例較低;在大白豬和梅山豬群體中均以BB基因型檢出比例較高，AB基因型次之，AA基因型檢出比例最低。總體來看，除了杜洛克豬群體的A等位基因頻率較高外，其他4個豬群體均以B等位基因頻率較高。【結(jié)論】豬BPI基因外顯子10 AA基因型頻率在杜洛克豬群體中最高，在大白豬和梅山群體中較低，在長白豬和申農(nóng)豬群體中未檢出，即AA基因型在杜洛克豬群體中比例高與其仔豬腹瀉發(fā)病率低的情況一致。因此，在大白豬和梅山豬育種過程中需提高AA基因型比例，而在長白豬和申農(nóng)豬育種過程中需引進AA基因型個體，降低BB和AB基因型比例，以增加仔豬的抗病能力。

關(guān)鍵詞： 豬;殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）;SNP位點;基因型;多態(tài)性

中圖分類號： S828.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0446-08

0 引言

【研究意義】斷奶仔豬腹瀉一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的難題，主要引起仔豬消瘦，影響其生長指標，嚴重者甚至引起死亡。引起仔豬腹瀉原因有很多，其中大腸桿菌和沙門氏菌是最主要的病原菌（鄭龍龍等，2015）。殺菌性/通透性增加蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）是脂多糖結(jié)合蛋白家族成員之一，定位于胞漿顆粒細胞中，為多形核中性粒細胞（PMNs）的主要抗菌成分（Canny and Levy，2008）。BPI在機體識別和調(diào)控革蘭氏陰性菌致病因子方面發(fā)揮重要作用，可中和內(nèi)毒素而降低炎癥反應(yīng)，其功能性N端還可殺死細菌，促進中性粒細胞對細菌的吞噬作用（Akin et al.，2011）。Tuggle等（2003）研究表明，BPI基因外顯子4和外顯子10的多態(tài)性與豬沙門氏菌易感性有關(guān);朱璟等（2011）研究認為，BPI基因外顯子10 AA基因型可能具有較高的免疫應(yīng)答能力，是提高對大腸桿菌抗性的有利基因型。因此，明確BPI基因外顯子在不同豬群體中的多態(tài)性對控制仔豬腹瀉具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自Weiss等（1978）最先從PMNs中分離獲得人類BPI以來，目前已從人類及豬、牛、小鼠、獼猴等哺乳動物中克隆獲得BPI基因（陳薇等，1997;高恒，2008），其中，豬BPI基因定位于第17號染色體上，含有15個外顯子和14個內(nèi)含子（魏麟，2012）。吳正常等（2013a）通過比較13個物種的BPI基因編碼區(qū)（CDS）序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除獼猴外，人類及豬、鼠等動物均具有BPI1和BPI2兩種保守的結(jié)構(gòu)域。人類與豬的BPI已被證實具有中和內(nèi)毒素及抗革蘭氏陰性菌的作用（周紅等，1999;Levy et al.，2003）。此外，Tuggle等（2003）檢測到BPI基因外顯子4和外顯子10分別存在AvaⅡ和HPaⅡ酶切多態(tài)性，其基因型與豬沙門氏菌的易感性有關(guān)，即BPI基因為抗病育種候選基因。袁樹楷（2007）研究發(fā)現(xiàn)，榮昌豬BPI基因外顯子3第397位存在的堿基突變（G→A），引起氨基酸由精氨酸（Arg）替換為谷氨酸（Gln），且該突變位點可能對榮昌豬BPI蛋白功能及機體天然免疫力有重要影響;而榮昌豬BPI基因外顯子4存在4個SNP位點（T512C、G551T、C563T和G599A），說明該片段具有較大的遺傳選擇潛力。陳平（2015）研究證實，豬源BPI N端不僅能殺滅大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌，還對L-型化膿鏈球菌等革蘭氏陽性菌具有抗菌活性。吳正常等（2015）通過篩選靶向干擾豬BPI基因表達的siRNA，以期從細胞水平研究BPI基因?qū)ωi腸道革蘭氏陰性菌抗感染的作用機制。Bülow等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，BPI通過結(jié)合革蘭氏陽性菌的脂肽、脂蛋白及脂磷壁酸而產(chǎn)生殺菌作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前，在豬場生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)長白豬及其培育品種申農(nóng)豬的仔豬腹瀉發(fā)病率較高，但是否與BPI基因外顯子多態(tài)性差異有關(guān)尚有待進一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分析豬BPI基因序列信息尋找可能存在變異位點（SNP位點），并檢測分析BPI基因外顯子10在上海地區(qū)5個豬群體中的多態(tài)性及其與抗病相關(guān)的優(yōu)勢基因型，為揭示BPI基因在仔豬腹瀉抗病機制中的作用及開展豬抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的5個豬群體樣品中，杜洛克豬（89頭）、大白豬（154頭）和長白豬（79頭）由上海祥欣畜禽有限公司提供，梅山豬（130頭）由上海豬狀元畜牧綜合場提供，申農(nóng)豬（75頭）由上海警備區(qū)富民農(nóng)場提供，共計527頭，所取樣品均為豬耳組織。所采樣品置于預(yù)先添加75%酒精的1.5 mL離心管中，以冰盒保存帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r從NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100286800）下載豬BPI基因的4條電子克隆序列和2條全長cDNA克隆序列，具體信息如表1所示。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 生物軟件分析 采用BioEdit、Lasergene和DNAMAN對下載的6條BPI基因序列進行比對分析，選取共有的CDS序列，其長度為1452 bp;同時對其編碼蛋白氨基酸序列進行比對分析。

1. 2. 2 DNA提取 采用AXYGEN組織DNA提取試劑盒提取豬耳組織基因組DNA，并稀釋至30 ng/mL， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 引物設(shè)計合成及PCR擴增 參照朱璟等（2011）的方法設(shè)計擴增引物（上游引物：5'-CCCAAC ATGGAGATGCAGTTC-3';下游引物：5'-CAATGAA TCAATGAGCACACC-3'），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：Master Mix 25.0 μL，BPI-F和BPI-R各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 4 PCR-RFLP檢測 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行酶切，酶切體系16.0 μL： PCR擴增產(chǎn)物4.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，HpaⅡ酶0.5 μL，ddH2O 9.5 μL;酶切時間約30 min。

1. 2. 5 基因型分析 PCR擴增獲得的目的基因片段存在HpaⅡ酶切位點，采用內(nèi)切酶HpaⅡ進行酶切后可產(chǎn)生3種基因型：AA型（445 bp）、BB型（304和142 bp）和AB型（445、304和142 bp）。根據(jù)酶切結(jié)果，不同基因型分別選取3個樣品進行測序。

1. 2. 6 基因型頻率和基因頻率計算 等位基因是指位于一對同源染色體相同位置上控制著相對性狀的一對基因，以A和B表示。依據(jù)群體遺傳學(xué)計算公式，分別計算等位基因頻率及其基因型頻率（王旭等，2017;王利平等，2018）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 豬BPI基因CDS序列分析結(jié)果

豬BPI基因CDS序列長度1452 bp，編碼483個氨基酸，其信號肽區(qū)域長度為27個氨基酸（第1～27位氨基酸），功能區(qū)BPI1長度為226個氨基酸（第35～260位氨基酸），功能區(qū)BPI2長度為204個氨基酸（第275～478位氨基酸）。根據(jù)NCBI提供的SNP GeneView信息可知，豬BPI基因CDS序列存在44個SNPs位點，其中22個為同義SNP位點、22個為非同義SNP位點。

2. 2 豬BPI基因電子克隆序列與全長cDNA序列的SNP位點比對分析結(jié)果

DANMAN分析結(jié)果顯示，豬BPI基因全長cDNA序列（EF436278.1和FJ810853.1）與電子克隆序列相比存在14處堿基差異，具體信息表2。其中，4條電子克隆序列完全一致。從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100286800）下載豬BPI基因DNA序列（NC_010459），然后根據(jù)其序列特征劃分BPI基因外顯子區(qū)域，15個外顯子長度分別為130、115、129、162、64、64、92、177、60、168、68、43、64、77和39 bp。電子克隆序列與全長cDNA序列的堿基差異分別位于：外顯子2（C401T）、外顯子3（A505G）、外顯子4（C582T、G607C、C615T、T654G、C666T和G702A）、外顯子6（C855T）、外顯子7（C925T）、外顯子8（G1005T）、外顯子10（A1258G）、外顯子13（T1533C）和外顯子15（C1647T）。

2. 3 豬BPI基因電子克隆蛋白序列與全長cDNA翻譯蛋白序列比對分析結(jié)果

豬BPI基因全長cDNA翻譯蛋白序列與電子克隆蛋白序列存在4處氨基酸差異，分別是第118位精氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚ˋrg→Gln）、第154位精氨酸突變?yōu)楦拾彼幔ˋrg→Gly）、第260位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Thr→Ser）和第371位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸（Ala→Thr）。其中，BPI1區(qū)域有3處氨基酸差異，BPI2區(qū)域僅有1處氨基酸差異。

2. 4 豬BPI基因PCR擴增結(jié)果

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的基因條帶大小為445 bp，且目的條帶單一明亮、無雜帶，符合后續(xù)的酶切要求。

2. 5 豬BPI基因測序結(jié)果

豬BPI基因PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果，其序列中存在Hap II酶切位點（C/CGG），在測序結(jié)果中以加粗下劃線標注酶切位點位置。

2. 6 各基因型測序分析結(jié)果

根據(jù)Hap II酶切電泳結(jié)果，3種基因型各選擇3個樣品進行測序。AA基因型突變位點處堿基為T時未形成Hap II（C/CGG）酶切位點，酶切后PCR片段長度不變，仍為445 bp;BB基因型突變位點處堿基為G時形成Hap II（C/CGG）酶切位點，酶切后PCR片段被分為304和142 bp 2個片段;AB基因型為雜合子，酶切后PCR片段被分為445、304和142 bp 3個片段。

2. 7 PCR-RFLP檢測結(jié)果

采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測Hap II酶切結(jié)果，結(jié)果顯示獲得的目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致。其中，AA基因型為1條條帶，BB基因型為2條條帶，AB基因型為3條條帶。說明待檢測樣品存在BPI基因外顯子10的3種基因型。當突變位點為T時未產(chǎn)生酶切位點，酶切產(chǎn)物長度445 bp;當突變位點為G時產(chǎn)生酶切位點，酶切產(chǎn)物長度為304和142 bp;當突變位點為T/G雜合子時，酶切產(chǎn)物長度分別為445、304和142 bp。

2. 8 BPI基因外顯子10在5個豬群體中的基因型及基因頻率

由表3可知，BPI基因外顯子10在杜洛克豬、長白豬、大白豬、申農(nóng)豬和梅山豬群體中各基因型的分布情況各不相同。在杜洛克豬群體中AA和AB基因型呈中度多態(tài)分布，BB基因型檢出比例較低;在長白豬和申農(nóng)豬群體中均未檢測出AA基因型，BB基因型檢出比例較高，而AB基因型檢出比例較低;在大白豬和梅山豬群體中均以BB基因型檢出比例較高，AB基因型次之，AA基因型檢出比例最低?？傮w來看，除了杜洛克豬群體的A等位基因頻率較高外，其他4個豬群體均以B等位基因頻率較高。

3 討論

BPI存在于多形核中性粒細胞（PMNs）中，能中和細菌釋放的脂多糖（LPS），并可激活磷脂，增強細胞膜通透性，導(dǎo)致細菌死亡，尤其對革蘭氏陰性菌具有廣泛的殺滅作用，在機體體內(nèi)被稱為超級抗生素（朱璟，2012）。BPI的N端與病原菌LPS結(jié)合，而C端結(jié)合于吞噬細胞表面，增強中性粒細胞對細菌的吞噬作用（Nishimura et al.，2001;高恒等，2009）。本研究通過分析NCBI上已公布的豬BPI基因序列，發(fā)現(xiàn)其全長cDNA克隆序列與電子克隆序列相比存在14處堿基差異，分別位于：外顯子2（C401T）、外顯子3（A505G）、外顯子4（C582T、G607C、C615T、T654G、C666T和G702A）、外顯子6（C855T）、外顯子7（C925T）、外顯子8（G1005T）、外顯子10（A1258G）、外顯子13（T1533C）和外顯子15（C1647T）;而對應(yīng)的翻譯蛋白序列存在4處氨基酸差異，分別是第118位Arg→Gln、第154位Arg→Gly、第260位Thr→Ser和第371位Ala→Thr。由于電子克隆序列是利用生物信息學(xué)技術(shù)組裝延伸ESTs序列所獲得，因此需采用全長cDNA克隆加以驗證。二者間存在的差異可能是突變位點所引起，其中在外顯子4上存在6處堿基差異和4個SNPs位點，與袁樹楷（2007）的研究結(jié)果一致，其余SNP位點則需在不同豬種群體進行差異位點檢測分析，以確定其遺傳變異規(guī)律。

目前，已有研究報道豬BPI基因外顯子1、外顯子3、外顯子4和外顯子10均存在SNP位點，且證實外顯子4和外顯子10的多態(tài)性與沙門氏菌易感性相關(guān)（袁樹楷，2007;曹曉華，2008;吳正常等，2013b;Wu et al.，2015）。朱璟等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，豬BPI基因外顯子10 AA基因型是有利基因型，對大腸桿菌F18菌株的抗性顯著或極顯著高于AB和BB基因型個體，且證實這種抗性與豬BPI基因在空腸和十二指腸上調(diào)表達有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，BPI基因外顯子10 AA基因型在外來豬種（杜洛克）群體中的比例較高，在地方品種（梅山豬）和大白豬群體中的比例較低，而在長白豬和申農(nóng)豬群體中均未檢測出AA基因型，與朱璟（2012）的研究結(jié)果一致。申農(nóng)豬是由長白×（大白×二花臉）經(jīng)橫交固定、世代選育形成的母本新品系，其特點是耐粗飼、母豬體型較小、耗料較少、飼養(yǎng)管理要求不高。以其為母本、大白豬為父本雜交獲得的子代在生長指標、肉色、肌內(nèi)脂肪等方面均優(yōu)于親本（胡志剛等，2010;談永松等，2011），但該雜交品系在育種過程中常遇仔豬腹瀉頻發(fā)的問題，是否與BPI基因外顯子10 AA基因型在檢測群體中缺失有關(guān)還有待進一步探究。

本研究通過檢測豬BPI基因在5個豬群體的遺傳變異情況，一方面可尋找疾病易感基因型的遺傳標記應(yīng)用于育種實踐，對提高豬的經(jīng)濟價值具有重要意義;另一方面，基因型分布可反映豬群體遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此，在申農(nóng)豬育種過程中應(yīng)重點關(guān)注BPI基因外顯子10 AA基因型比例的增加情況。此外，需進一步結(jié)合5個豬群體的仔豬腹瀉情況進行相關(guān)分析，從而判定仔豬腹瀉與豬BPI基因外顯子10基因型是否相關(guān)，并確定是否還存在控制疾病發(fā)生發(fā)展的其他協(xié)同基因。

4 結(jié)論

豬BPI基因外顯子10存在AA、BB和AB 3種基因型，AA基因型頻率在杜洛克豬群體中最高，在大白豬和梅山群體中較低，在長白豬和申農(nóng)豬群體中未檢出，即AA基因型在杜洛克豬群體中比例高與其仔豬腹瀉發(fā)病率低的情況一致。因此，在大白豬和梅山豬育種過程中需提高AA基因型比例，而在長白豬和申農(nóng)豬育種過程中需引進AA基因型個體，降低BB和AB基因型比例，以增加仔豬的抗病能力。

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（責任編輯 蘭宗寶）