白英俊 李國(guó)瑞 黃鳳蘭 李威

摘要：基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)植物遺傳育種及作物性狀的改良產(chǎn)生了深遠(yuǎn)意義。CRISPR/Cas（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat）是由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)蛋白組成的免疫系統(tǒng)，其作用是原核生物（40%細(xì)菌和90%古細(xì)菌）用來抵抗外源遺傳物質(zhì)（噬菌體和病毒）的入侵。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組中多個(gè)靶基因同時(shí)進(jìn)行編輯，與前兩代基因編輯技術(shù)：鋅指核酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酶（TALENs）相比更加簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效。目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）、煙草（Nicotianabenthamiana）、水稻（Oryzasativa）、小麥（Triticumaestivum）、玉米（Zeamays）、番茄（tomato）等模式植物和多數(shù)大作物中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯，其應(yīng)用范圍不斷地向各類植物擴(kuò)展。但與模式植物和一些大作物相比，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在非模式植物，尤其在一些小作物的應(yīng)用中存在如載體構(gòu)建、靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、脫靶檢測(cè)、同源重組等問題有待進(jìn)一步完善。該文對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)在非模式植物與小作物研究的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，討論了該技術(shù)目前在非模式植物、小作物應(yīng)用的局限性，在此基礎(chǔ)上提出了相關(guān)改進(jìn)策略，并對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的研究前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)，植物遺傳育種，基因組編輯，非模式植物

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）03-0419-08

遺傳突變對(duì)于研究植物基因功能和作物遺傳改良至關(guān)重要。在過去，自然突變體的表征已經(jīng)揭示了遺傳多樣性的重要性。而且，許多研究已經(jīng)使用了物理方法（γ輻射）、化學(xué)方法（甲磺酸乙酯）或生物方法（例如T-DNA/轉(zhuǎn)座子）導(dǎo)致點(diǎn)突變、缺失、重排和基因重組得到突變體。但隨機(jī)誘變會(huì)產(chǎn)生許多不希望的突變，以及大規(guī)模的篩查突變體不僅工作繁瑣且成本昂貴。序列特異性核酸酶（SSNs）的出現(xiàn)在基因定點(diǎn)誘變方面實(shí)現(xiàn)了突破。SSN可以誘導(dǎo)特定的雙鏈斷裂（DSBs）染色體位點(diǎn)，此核酸酶可以引起的兩種不同的DNA雙鏈修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（nonhomologousend-joining，NHEJ）和同源重組型修復(fù)（homology-directedrepair，HDR）。鋅指核酸酶（ZFNs）作為第一代SSNs（Bibikovaetal.，2002）被用于編輯植物基因組（Petolino，2015）。然而，ZFN結(jié)構(gòu)難以操作且成本高昂，極大地阻礙了它們?cè)诟黝愔参锂?dāng)中的應(yīng)用（Sanjanaetal.，2012）。之后TALEN的開發(fā)并在植物中應(yīng)用（Boch&Bonas，2010），雖然在載體的構(gòu)建及操作上比ZFN更容易但是使用TALEN仍然需要建造復(fù)雜的串聯(lián)在TAL蛋白中的重復(fù)結(jié)構(gòu)域且成本仍然很高。

CRISPR技術(shù)的問世加速了基因編輯工程的進(jìn)程，突破了前兩代基因編輯技術(shù)對(duì)每個(gè)靶基因確定不同的核酸酶的局限性（Sunetal.，2016;Eyquemetal.，2017;Svitashevetal.，2015）。相比與前兩代基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需要對(duì)每1個(gè)基因靶位點(diǎn)修飾合成1個(gè)靶標(biāo)sgRNA（singleguideRNA），實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組精確定點(diǎn)編輯。除此之外CRISPR/Cas9還有系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)成本低、編輯效率高等優(yōu)勢(shì)。目前該技術(shù)已在擬南芥、水稻、玉米（Wangetal.，2017;Kleinstiveretal.，2016）等模式植物中實(shí)現(xiàn)了精確的定點(diǎn)突變，且正在進(jìn)一步向更多的植物中實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值。

1CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本組成結(jié)構(gòu)

一個(gè)完整的CRISPR序列組件應(yīng)該含有重復(fù)序列區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）。間隔區(qū)的功能在于外源DNA序列的識(shí)別與俘獲（Demircietal.，2018）短而保守的重復(fù)序列區(qū)內(nèi)存在回文序列，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的降解。序列的上游存在一個(gè)啟動(dòng)CRISPR的前導(dǎo)區(qū)（Doudna&Charpentier，2014），破壞外源入侵基因時(shí)需要在前導(dǎo)區(qū)上游的Cas蛋白基因家族的共同作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。最后CRISPR序列和Cas蛋白基因組合成一個(gè)高度保守的CRISPR/Cas9系統(tǒng)（Osakabe&Osakabe，2015;Petolino，2015）。

CRISPR系統(tǒng)分成3個(gè)類型：Type1、Type2、Type3。Type1型在細(xì)菌和古生菌中均有分布（Puchta&Fauser，2014），Type1型較其他兩型相比組成最為復(fù)雜，不僅有多個(gè)亞型還包含了多種Cas蛋白，最核心蛋白元件為Cas3蛋白，該蛋白是一個(gè)含有多結(jié)構(gòu)域的蛋白，但每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有不同的功能，其主要功能是核酸酶和解旋酶;Type2型的核心蛋白是含有HNH和RuvC兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域的Cas9蛋白（Panetal.，2016）;其中HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域在CRISPR系統(tǒng)中可以加工產(chǎn)生crRNA，對(duì)外源基因的剪切、降解有著重要作用，目前運(yùn)用最為廣泛操作最為簡(jiǎn)單的就是Type2型CRISPR系統(tǒng)（Lander，2016）;Type3型系統(tǒng)存在于少數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌，Cas6和Cas10蛋白元件包含在該系統(tǒng)中，其主要功能是參與crRNA的加工和入侵DNA的降解。

2CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理

Type2型CRISPR-Cas系統(tǒng)只需要三個(gè)組件，即Cas9、RNA（tracrRNA）、CRISPRRNA（crRNA）識(shí)別和定位該系統(tǒng)病原體的遺傳物質(zhì)通過三步過程，即獲得、表達(dá)和干擾（Uncklessetal.，2017;Shenetal.，2013）。第一階段俘獲外源DNA：當(dāng)噬菌體和病毒入侵時(shí)，細(xì)菌的間隔序列將俘獲外源基因的一小片段DNA序列，外源基因與間隔序列識(shí)別的序列被稱為protospaceradjacentmotif（PAM位點(diǎn)：NGG，N為任意堿基）;第二階段crRNA的表達(dá)：將臨近PAM的間隔序列修飾加工并整合到自身CRISPR基因座中，轉(zhuǎn)錄為Crispr前體RNA（CrisprprecursorRNA，precrRNA），之后進(jìn)一步形成crRNA（shortCRISPR-derivedRNA，crRNA）（Shenetal.，2014;Samantaetal.，2016）;第三階段靶向干擾：對(duì)外源基因的降解除了需要成熟的crRNA之外還需要一些特異性較好的小分子RNA（tracrRNA反式激活RNA）的幫助。crRNA與tracrRNA形成新的復(fù)合體RNA，在與Cas9蛋白經(jīng)sgRNA的引導(dǎo)在PAM位點(diǎn)處與外源DNA互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)降解（Puchta，2017;Xieetal.，2015）。

3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物、小作物當(dāng)中的應(yīng)用

通常情況下非模式植物是指生長(zhǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)、且基因組尚未得到透徹研究的植物。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)通過對(duì)基因的移碼突變、片段刪除及基因修改等功能，成為了植物遺傳改良和分子設(shè)計(jì)的理想途徑。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在更多非模式植物當(dāng)中的應(yīng)該不僅提高了生物多樣性，而且對(duì)于開發(fā)更多植物的潛力有著重要意義。該技術(shù)已經(jīng)逐漸在很多非模式植物中實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)編輯（表1）。

3.1糙葉山黃麻（Parasponia）屬于榆科的熱帶樹種，被稱為唯一可以與根瘤菌建立固氮內(nèi)生真菌的非豆科植物

Vanetal.（2018）通過使用擬南芥AtU6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，其中Cas9蛋白用35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，使CRISPR/Cas9介導(dǎo)誘變PanHK4、PanEIN2、PanNSP1和PanNSP2四個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)PanNSP1和PanNSP2是根瘤形成的必要條件。

3.2楊樹（Populus）是楊屬植物，全屬有100多種

楊木除了用于制作家具、造紙和火柴之外可廣泛用于生態(tài)防護(hù)林、三北防護(hù)林、農(nóng)林防護(hù)林和工業(yè)用材林。楊樹做為道路綠化，園林景觀用也是一個(gè)非常優(yōu)秀的樹種。Elorriaga（2016）以pK2GW7為CRISPR/Cas9基因編輯載體定點(diǎn)突變LEAFY與AGAMOUS基因，發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)闂顦湔T導(dǎo)雄性、雌性的必要基因。

3.3地錢（Marchantiapolymorpha）是苔蘚類植物中分布最為廣泛的物種之一

Suganoetal.（2014）以生長(zhǎng)素調(diào)控因子ARF1為靶基因，用U6-1的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA，以及35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含核定位信號(hào)的Cas9蛋白，實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9在地錢當(dāng)中的應(yīng)用。

3.4苜蓿是苜蓿屬（Medicago）植物的通稱，俗稱金花菜，是一種多年生開花植物

Mengetal.（2017）以pFGC5941為CRISPR/Cas9基因編輯載體，以苜蓿U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)特定sgRNA，35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白對(duì)蒺藜苜蓿的PDS基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，并在T0代得到10.35%的純合敲除突變體，為苜蓿等豆科牧草的功能基因組學(xué)研究提供了新的研究工具。

3.5百脈根（Lotuscorniculatus），豆科，屬多年生草本植物

百脈根不僅可以作為飼料，還可以用于田地土壤的改良植物。Wangetal.（2016）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)百脈根共生固氮SNF相關(guān)基因進(jìn)行了編輯研究。

3.6甜橙（Citrussinensis），喬木，枝少刺或近于無(wú)刺

橙子中含量豐富的維生素C、P，有著能增加機(jī)體抵抗力的作用。Jia&Wang（2014）以pBI121為CRISPR/Cas9基因編輯載體，靶向編輯CsPDS基因，檢測(cè)突變頻率在3.2%～3.9%，為今后利用該技術(shù)進(jìn)行柑橘的品種改良奠定了基礎(chǔ)。

3.7香蕉（Musaspp.）是一種重要的熱帶水果和糧食作物

胡春華等（2017）構(gòu)建了以MaPDS為靶標(biāo)基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA載體。該載體中的Cas9蛋白由PUbi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，而sgRNA由水稻來源的U6a驅(qū)動(dòng)，成功的獲得了抗性植株。

3.8作為全球最重要的水果作物之一，葡萄（grape）具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值

Renetal.（2016）以IdnDH為靶基因的pCACRISPR/Cas9二元載體。其中擬南芥U6啟動(dòng)子（AtU6）驅(qū)動(dòng)sgRNA，Cas9蛋白基因又以35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在葡萄當(dāng)中的應(yīng)該最終獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

3.9矮牽牛（Petunia），碧冬茄屬，茄科，正式名碧冬茄，多年生草本植物

廣泛用于花壇布置，花槽配置，景點(diǎn)擺設(shè)，窗臺(tái)點(diǎn)綴，家庭裝飾。Zhangetal.（2016a）以PGGE為載體，利用CRISPR/Cas9靶向編輯了類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵酶PDS基因，成功獲得了突變體植株。

4目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的局限性

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式作物和一些大作物中已經(jīng)得到了充分的利用，如擬南芥、玉米、水稻、小麥等。但是擴(kuò)展到非模式植物尤其是一些其開發(fā)潛力巨大實(shí)用價(jià)值有待提高的小作物，如蓖麻、蕎麥、絲瓜、薺菜等，還存在著一定的局限性。

4.1非模式植物中CRISPR/Cas9載體構(gòu)建問題

在進(jìn)行CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體構(gòu)建時(shí)，與非模式和小作物相比模式植物和大作物的研究較為透徹，可用其專屬啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)敲除載體。而大多數(shù)非模式植物尤其是小作物只能使用通用的強(qiáng)啟動(dòng)子（擬南芥U6）來驅(qū)動(dòng)CRISPR/Cas9-sgRNA（Fauseretal.，2014;Zhang&Zhou，2014;D′halluink&Ruiter，2013）。經(jīng)不斷的研究一些科研人員構(gòu)建了一套可以作為雙子葉植物或單子葉作物的通用載體（Khatodiaetal.，2017）。這些通用的CRISPR/Cas9載體只需將物種進(jìn)行單雙子葉的區(qū)分便可以進(jìn)行基因編輯。但這些通用載體對(duì)植物的適應(yīng)性及敲除效率是否優(yōu)于植物的專屬敲除載體，其結(jié)果有待驗(yàn)證。

4.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)問題

自CRISPR/Cas9系統(tǒng)開創(chuàng)到應(yīng)用，衍生出了包括人、動(dòng)物、植物在內(nèi)的在線和/或單機(jī)版共有20多種sgRNA設(shè)計(jì)軟件。如CRISPRDesign、CRISPR-P等軟件（Leietal.，2013）。按照操作平臺(tái)、選擇物種、輸入序列、參數(shù)設(shè)置、結(jié)果輸出等內(nèi)容，通過制定30多個(gè)評(píng)測(cè)指標(biāo)來確定靶基因的靶點(diǎn)。但是這些設(shè)計(jì)軟件在智能涵蓋的大多數(shù)模式植物和大的經(jīng)濟(jì)作物，還有很大一部分非模式植物及小作物目前沒有相應(yīng)的sgRNA設(shè)計(jì)軟件。相關(guān)研究人員不得不根據(jù)常規(guī)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則：

（1）靶點(diǎn)序列長(zhǎng)度18～22bp，一般選擇20bp;（2）選擇的靶點(diǎn)序列應(yīng)盡量靠近起始密碼子。一般以第一個(gè)或第二個(gè)外顯子為最佳;（3）選擇特異性較好的靶點(diǎn)序列相，盡量避免重復(fù)序列、多聯(lián)A序列，多聯(lián)T序列;GC含量為40%～50%為最佳;（4）靶點(diǎn)5’端允許1～2bp的錯(cuò)配，但應(yīng)保障靶點(diǎn)堿基匹配數(shù)不小于18bp。

為了確保敲除位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，通過基因外顯子核苷酸序列找到PAM位點(diǎn)手動(dòng)設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA。這為后期靶點(diǎn)檢測(cè)確定特異性好的sgRNA增加了工作量。

4.3CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的基因編輯效率與脫靶評(píng)估問題

對(duì)確定的靶點(diǎn)進(jìn)行效率檢測(cè)和脫靶評(píng)估時(shí)模式植物除了用實(shí)驗(yàn)方法外。如酶切法、SMART測(cè)序法、SSA報(bào)告載體活性檢測(cè)法、Sanger測(cè)序法等（Yangetal.，2013;Hendeletal.，2014;Yinetal.，2015）。以綜合各類脫靶檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，衍生出了定量分析基因敲除效率的相關(guān)軟件，如CRISPR-GA（CRISPRGenomeAnalyzer，http：//54.80.152.219/）。目前非模式植物只能通過體外轉(zhuǎn)錄sgRNA及體外酶切靶點(diǎn)DNA片段反應(yīng)通過與已知活性的標(biāo)準(zhǔn)sgRNA靶點(diǎn)進(jìn)行比較來評(píng)價(jià)目標(biāo)sgrna的特異性（Cradicketal.，2014;Sunetal.，2015）。此活性測(cè)定雖然不難但是過程較為繁瑣加上需做重復(fù)試驗(yàn)來最終確定活性較高的sgRNA，耗時(shí)耗力。

4.4CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非植物中的重組效率問題

重組效率低是CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式植物和在非模式植物的通病，常規(guī)CRISPR使用與核酸酶（最常見的是Cas9）偶聯(lián)的指導(dǎo)RNA（gRNA），其一起連接到特定的DNA堿基區(qū)域;然后核酸酶剪切雙螺旋（Wangetal.，2015）。細(xì)胞修復(fù)機(jī)制嘗試重新加入切割的DNA末端，但偶爾會(huì)插入或刪除一些堿基，這將使DNA代碼變成亂碼，并且可能誤敲除靶基因。為了修復(fù)點(diǎn)突變，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還必須引入具有正確堿基的“供體”DNA鏈，然后依靠稱為同源性定向修復(fù)（HDR）的第二種細(xì)胞機(jī)制。但是此修復(fù)模式依賴于細(xì)胞分裂狀態(tài)，細(xì)胞分裂差HDR的作用也就很差。

4.5CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的遺傳轉(zhuǎn)化問題

利用遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植株，重點(diǎn)在于轉(zhuǎn)化效率。目前相關(guān)研究表明轉(zhuǎn)化效率與載體大小成反比。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，通常Cas9蛋白原件大于5kb，所以遺傳轉(zhuǎn)化效率在一定程度會(huì)受到影響。雖然一些研究發(fā)現(xiàn)通過以連續(xù)轉(zhuǎn)化的方式（即首先得到hCas9轉(zhuǎn)基因植株，之后將卸載Cas9的小型sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至hCas9植株中）得到了與直接轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas9同樣的突變體植株，但此方法多適用于以葉片為受體的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，且hCas9基因整合至植物基因組中有無(wú)毒害作用目前尚未可知（Lowderetal.，2015;Mikamietal.，2015）。

4.6單堿基基因編輯系統(tǒng)在非模式植物中的應(yīng)用問題

CRISPR/Cas9單堿基編輯系統(tǒng)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了DNA雙鏈不發(fā)生斷裂的情況下，通過sgRNA靶向定位，利用胞嘧啶核苷脫氨酶進(jìn)行堿基編輯（魏瑜等，2017）。這項(xiàng)技術(shù)的成功糾正效率為23%～35%。目前該系統(tǒng)已經(jīng)在模式植物中得到應(yīng)用。此技術(shù)的不足之處在于，該系統(tǒng)只能實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基C→T或G→A的編輯。單堿基編輯系統(tǒng)的活性窗口仍然較大。單堿基編輯系統(tǒng)仍然會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)產(chǎn)生極少量DNA序列插入或缺失。

5提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非模式植物中的應(yīng)用效率相關(guān)策略

5.1完善非模式植物全基因組測(cè)序

全基因組測(cè)序的目的是獲得物種的基因組序列，它可以研究基因組水平上物種的生長(zhǎng)、發(fā)育、進(jìn)化和起源加深對(duì)物種的了解，并在發(fā)現(xiàn)新基因和改進(jìn)改良育種中發(fā)揮重要作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因組編輯研究，可以全面挖掘基因功能獲得重要的遺傳信息（Zhangetal.，2016b）。許多非模式植物，在各種極端生境中具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性和生長(zhǎng)能力，CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用將促進(jìn)在極端生境中生長(zhǎng)的一些特殊性狀基因的探索，如耐旱基因、耐鹽基因、耐冷基因等。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用加速了探索基因代謝途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并可以通過基因敲除和插入突變，以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的改造。

5.2sgRNA和ssODNs的設(shè)計(jì)

在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)中，Cas9蛋白在特定靶位點(diǎn)上的裂解主要是由PAM序列和單鏈RNA（sgRNA）中的20nt序列決定的。因此，sgRNA序列的選擇具有靶向性，直接決定了Cas9蛋白核酸酶的定位位置。首先，必須有PAM序列，其中PAM序列是NGG（N是任意堿基）序列。其次，為了減少切割過程中Cas9蛋白的缺失率，sgRNA序列應(yīng)該與基因組上的靶序列高度匹配（Cencicetal.，2014）。此外，sgRNA與基因組其它位點(diǎn)的同源性最差，否則很容易導(dǎo)致錯(cuò)配。最后在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)將其長(zhǎng)度從20nt縮短到17nt，有助于降低錯(cuò)配幾率。

在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)中，sgRNA的設(shè)計(jì)和選擇非常重要。但在定點(diǎn)修改中，同源修復(fù)模板（ssODNS）的設(shè)計(jì)也是一個(gè)關(guān)鍵問題。兩種不同的DNA修復(fù)模式（HR和NHEJ）在雙鏈斷裂后被誘導(dǎo)。兩種DNA修復(fù)方法的區(qū)別在于HR需要1個(gè)同源修復(fù)模板，即短鏈DNA，即單鏈寡核苷酸（ssODNs）。使用該模板的HR可以進(jìn)行精確的點(diǎn)突變、插入和敲除DNA。當(dāng)在靶位點(diǎn)引入1個(gè)大片段DNA序列時(shí)，修復(fù)模板也可以是含有同源臂的1個(gè)雙鏈質(zhì)粒。近年來，ssODNs替代了雙鏈質(zhì)粒在基因組位點(diǎn)修飾中的應(yīng)用。為了提高修復(fù)效率，ssODN包括和靶向序列互補(bǔ)的，分別沿著至少3′方向和5′方向延伸至少40nt的序列（Ranetal.，2013）。在此基礎(chǔ)上最好引入酶切位點(diǎn)，這樣就可以用限制性酶切多態(tài)性實(shí)驗(yàn)（RFLP），很方便的檢測(cè)基因編輯系統(tǒng)是否有效。

5.3Cas9蛋白的改造

由于CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，研究人員除了開發(fā)野生型SpCas9系統(tǒng)之外，還開發(fā)了新成員。在2015年，張峰團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種更簡(jiǎn)單的核酸酶（-Cpf1），它比Cas9更簡(jiǎn)單它可以單獨(dú)完成crRNA的加工和成熟，而不依賴于核糖核酸酶（RNase）和tracrRNA。-Cpf1不僅可以切割DNA序列，而且可以作用于RNA，并且沒有脫靶現(xiàn)象（Kimetal.，2016）。同年，張峰研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的蛋白質(zhì)C2C2，僅針對(duì)細(xì)菌中特定的RNA序列進(jìn)行切割。這些新發(fā)現(xiàn)可以為研究者解決未來的問題提供便利。

6展望

CRISPR/Cas9技術(shù)自2013年問世以來，已經(jīng)迅速的普及到多種植物的遺傳育種當(dāng)中，相對(duì)于前兩代TALENs＼＼ZFNs的基因編輯技術(shù)而言，敲除效率高、操作更加簡(jiǎn)便、耗材少，適用于很多實(shí)驗(yàn)室。在植物領(lǐng)域CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因組編輯主要應(yīng)用于模式植物和部分大作物，但要實(shí)現(xiàn)技術(shù)的應(yīng)用普及至更多的非模式植物和小作物中，在未來需要進(jìn)一步改進(jìn)和完善。（1）特異性基因的發(fā)掘。雖然目前許多模式植物，尤其是大作物的全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成。但是，很多非模式植物的基因組序列還尚未明確，許多關(guān)于重要性狀的基因還有待鑒定，一定程度上阻礙了CRSPR/Cas9技術(shù)在植物基因工程育種中的應(yīng)用。（2）載體構(gòu)建效率有待提高。目前在非模式植物中，sgRNA的設(shè)計(jì)主要通過研究人員對(duì)植物基因外顯子手動(dòng)設(shè)計(jì)，且對(duì)sgRNA的特異性還要經(jīng)過試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證確定，嚴(yán)重影響后期的敲除效率，在沒有相關(guān)輔助軟件的情況下，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。（3）非模式遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。目前，還有許多非模式植物由于沒有有效遺傳轉(zhuǎn)化體系難以應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，加之該系統(tǒng)載體相對(duì)較大，對(duì)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率也有一定的影響。（4）HDR發(fā)生頻率的提高。目前CRISPR/Cas9技術(shù)的研究主要是通過敲除靶位點(diǎn)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。所以如何通過改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將HDR在基因組靶位點(diǎn)引入相關(guān)功能基因，將成為CRISPR/Cas9技術(shù)在植物基因工程改良工作中的重點(diǎn)突破方向。相信隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展這些問題終將被克服，它的出現(xiàn)必將給植物基因工程帶來更好的發(fā)展。

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