劉亞男　賀廣生　韋建玉　賈海江　黃崇峻　蔡一霞　蔡昆爭　潘伯桂　王維

摘? 要：為了解添加不同有機物料的土壤厭氧消毒（Anaerobic soil disinfection，ASD）對土壤質(zhì)量及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，設(shè)置了煙梗、水稻秸稈、菜粕、米糠、甘蔗渣5種有機物料和不添加物料（CK1）的ASD處理，以原始土壤為對照（CK），分析了不同處理的土壤質(zhì)量和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，與CK相比，ASD處理均可顯著提高土壤pH，降低土壤EC和Eh，改善土壤養(yǎng)分，其中添加煙梗顯著提高了速效鉀、有機質(zhì)的含量，菜粕顯著提高了全氮、有機質(zhì)、速效氮含量及過氧化氫酶以及脲酶的活性。利用16S rDNA對土壤細(xì)菌測序表明，ASD顯著改變了細(xì)菌門類水平上各種群的比例，其中添加菜粕和煙梗的ASD處理微生物構(gòu)成與CK、CK1差異較大，厚壁菌門及其門下厭氧型細(xì)菌梭菌科、瘤胃菌科和耐受性細(xì)菌芽孢桿菌科的相對豐度顯著增加，而其土壤青枯菌數(shù)量卻顯著降低?？偟膩砜?，添加不同有機物料的ASD對植煙土壤的理化性狀和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生顯著不同的影響，其中添加菜粕和煙梗的ASD明顯改善土壤養(yǎng)分，影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性，厭氧和耐受型細(xì)菌豐度大幅增加，青枯菌數(shù)量減少。

關(guān)鍵詞：土壤厭氧消毒;土壤質(zhì)量;土壤細(xì)菌多樣性

中圖分類號：S572.01?? ???????文章編號：1007-5119（2019）03-0039-08????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.006

In order to explore the effects of anaerobic soil disinfection （ASD） with the additions of different organic substances on the quality and bacterial community structure of the soil， ASD treatments were carried out by adding tobacco stem， rice straw， rapeseed meal， rice bran， sugarcane bagasse， with no addition （CK1）， and the primary soil （CK） as controls. The results showed that ASD increased soil pH and reduced soil EC and Eh significantly， and improved soil nutrients. Tobacco stem increased the contents of available potassium and organic matter significantly， while rapeseed meal raised the contents of total nitrogen， organic matter， available nitrogen and the activities of catalase and urease. Sequencing of soil bacteria by 16S rDNA showed that ASD changed the ratios of soil bacterial communities at the phylum level， and there were obviously differences in the treatments of different organic substances. Significant differences were found in the bacterial composition of rapeseed meal and tobacco stem treatments when compared with CK and CK1. The relative abundances of the anaerobic bacteria ， and were also greatly improved， while the numbers of treated with ASD were greatly reduced， especially for the treatments of adding rapeseed meal and tobacco stem . In conclusion， ASD with the addition of different organic substances had obviously different effects on the physical and chemical properties and bacterial community structure of the tobacco-planting soil. ASD by adding rapeseed meal and tobacco stem significantly improved the soil nutrients， and changed the composition and diversity of the bacterial community， and increased the abundance of anaerobic and tolerant bacteria， which， in turns， decreased the number of significantly.

anaerobic soil disinfection; soil quality; soil bacterial diversity

土壤厭氧消毒法（Anaerobic soil disinfection，ASD）是近些年來發(fā)展的一種防控土傳病害和改善土壤質(zhì)量的非化學(xué)的土壤消毒方法，其基本原理是在厭氧的條件下，土壤環(huán)境劇烈變化以及有機物料發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種混合物對病原菌、雜草、線蟲產(chǎn)生抑制。該方法不僅能有效控制土傳病害和雜草，還能充分利用農(nóng)業(yè)廢棄物來改善土壤質(zhì)量。朱同彬等研究發(fā)現(xiàn)ASD可以快速修復(fù)因酸化、次生鹽漬化而嚴(yán)重退化的大棚蔬菜地土壤，減緩?fù)寥赖倪B作障礙。伍朝榮等研究表明ASD可以有效改善番茄地土壤質(zhì)量，顯著增加土壤養(yǎng)分含量，有效降低了土壤中青枯菌的數(shù)量和控制番茄青枯病的發(fā)生。BUTLER等研究同樣證明ASD處理可以提高土壤有機質(zhì)含量，改善土壤結(jié)構(gòu)。再者，ASD方法還是一種廣譜的土傳病原菌滅菌方法，對鐮刀菌、腐霉菌、茄科勞爾氏菌和植物寄生根結(jié)線蟲等均有很好的防治效果。

現(xiàn)有研究表明，土壤微環(huán)境及微生物區(qū)系變化是連作障礙產(chǎn)生的重要機制，微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是連作條件下土傳病害發(fā)生的主要原因。因此，從土壤微生態(tài)調(diào)控角度尋找有效的、無污染技術(shù)措施改良煙田土壤質(zhì)量來降低土傳病害的發(fā)生具有十分重要的理論價值和實踐意義。研究表明，碳源類型對消毒效果有直接影響。本研究利用ASD技術(shù)，探索添加不同有機物料ASD對土壤青枯菌、土壤質(zhì)量、土壤酶活性及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，其結(jié)果可為ASD技術(shù)推廣利用、構(gòu)建健康和諧的煙田土壤生態(tài)系統(tǒng)及克服煙草連作障礙提供理論依據(jù)和實踐參考。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

試驗于2018年5月以廣東省梅州市大埔縣（24°35' N，116°70' E）土壤退化、連作障礙嚴(yán)重的煙田表層土壤（0～20 cm）為供試土壤，土壤類型為砂泥土。用梅花布點法7點采集土壤樣品，經(jīng)自然風(fēng)干、清除雜物后過2 mm篩，混勻后貯于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)樓419室干燥處備用。供試土壤基本理化性質(zhì)：pH 4.5、電導(dǎo)率0.523 mS/cm、有機質(zhì)42.30 g/kg、速效氮26.81 mg/kg、速效鉀54.26 mg/kg、速效磷101.91 mg/kg。

添加的5種有機物分別為煙梗、水稻秸稈、菜粕、米糠、甘蔗渣，經(jīng)烘干后粉碎，過0.45 mm孔徑篩于干燥處儲存?zhèn)溆?。?為5種有機物料的全碳和全氮含量以及碳氮比，是各個有機物料經(jīng)4次重復(fù)測定后的平均值。

1.2? 試驗設(shè)計

采用添加不同有機物料和飽和水分處理的方法創(chuàng)造強還原厭氧條件，試驗設(shè)置了飽和水分處理（CK1）、添加煙梗并飽和水分處理（YG）、添加水稻秸稈并飽和水分處理（JG）、添加菜粕并飽和水分處理（CP）、添加米糠并飽和水分處理（MK）、添加甘蔗渣并飽和水分處理（GZ）等6個處理，以不添加物料不加水處理土壤為對照（CK）。每個處理設(shè)4個重復(fù)，共28份處理樣品。參照伍朝榮等方法，有機物料的添加量為2%（物料與土壤的質(zhì)量比），1 kg土樣與20 g有機物料及水充分混勻后裝入自封袋中（32 cm×45 cm），密封，置于28 ℃培養(yǎng)箱恒溫處理21 d。

厭氧處理結(jié)束后，各處理分成2份，一份直接用于各處理青枯菌數(shù)量、微生物高通量測序以及土壤氧化還原電位的測定;另一份風(fēng)干后，過100目篩，用于測定各處理的電導(dǎo)率（EC）、pH、有機質(zhì)、全氮、速效氮、速效磷、速效鉀以及土壤酶活性。

1.3? 測定內(nèi)容

1.3.1? 土壤理化性質(zhì)? 利用ST2100型酸度計測量土壤pH;利用D25-708C多參數(shù)分析儀測量土壤電導(dǎo)率（EC）;利用SX-630型OPR行測量土壤氧化還原電位（Eh），具體測量方法參照伍朝榮等。土壤樣品風(fēng)干后過100目篩，利用vario TOC分析儀進(jìn)行土壤全碳與全氮的測定;土壤速效氮測定方法參照文獻(xiàn)[11];土壤速效鉀、速效磷測定方法參照文獻(xiàn)[12];土壤過氧化氫酶、脲酶測定方法參照文獻(xiàn)[13];土壤蔗糖酶測定方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.3.2? 土壤青枯菌數(shù)量? 土壤青枯菌數(shù)量測量采用SMSA培養(yǎng)基，采用平板計數(shù)法測定土壤中青枯菌數(shù)量。

1.3.3? 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析? 土壤細(xì)菌測序由廣州基迪奧生物科技有限公司利用16S rDNA技術(shù)進(jìn)行測定與分析。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

采用IBM Statistics SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較（=0.05）。利用Excel 2013軟件作圖。

2? 結(jié)? 果

2.1? 不同有機物料對ASD處理土壤pH、Eh和EC的影響

從圖1A可知，與CK相比，添加有機物料的ASD處理可以顯著提高土壤pH，不同有機物料處理之間差異顯著，其中YG和CP使土壤pH值顯著升高，分別提高至6.2和6.4。圖1B表明ASD顯著降低土壤Eh，JG、CP、MK和GZ的土壤Eh顯著低于CK1，分別降低至?570.5、?435.5、?318和?289.5 mV，但YG處理與CK1無顯著差異（<0.05）。ASD也明顯降低土壤EC（圖1C），CK1的EC顯著低于CK，添加有機物料進(jìn)一步降低了厭氧消毒后土壤EC（YG除外），但JG、MK和GZ三處理的土壤EC間無顯著差異。

2.2? 不同有機物料對ASD處理土壤主要養(yǎng)分含量的影響

由表2可知，CK1土壤的有機質(zhì)、全氮和速效氮與CK間無顯著差異，而速效鉀顯著低于CK，速效磷含量明顯增加。添加有機物料可明顯改善土壤養(yǎng)分，提高ASD后土壤有機質(zhì)、全氮、速效氮、磷、鉀含量;其中CP處理土壤的有機質(zhì)、全氮和速效氮含量顯著增加，較CK分別增加18.7%、55%和150%;而YG顯著提高了土壤有機質(zhì)和速效鉀含量，較CK分別增加18.7%和123%;5種有機物料的土壤速效磷含量明顯增加，但物料間無顯著差異。

2.3? 不同有機物料對ASD處理的土壤主要酶活性的影響

從圖2看出，有機物料對ASD處理的土壤過氧化氫酶和土壤脲酶影響趨勢基本一致，只有CP處理的土壤過氧化氫酶和土壤脲酶活性顯著增加，較CK分別提高了64%和87%。不同有機物料處理的土壤蔗糖酶活性表現(xiàn)卻不同，JG和MK與其他物料間存在明顯差異，顯著提高了土壤蔗糖酶活性，分別比CK增加了3.1倍和2.89倍，而其他物料與CK和CK1無明顯差異。

2.4? 土壤厭氧消毒對土壤細(xì)菌微生物的影響

2.4.1? 不同有機物料的ASD處理后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化? 由表3可見，土壤細(xì)菌群落的豐富度（Chao1指數(shù)，ACE）以及群落多樣性的高低（Observed species，Shannon指數(shù)）對ASD及不同有機物料添加的響應(yīng)趨勢基本一致，ASD明顯降低土壤細(xì)菌群落的豐富度，多樣性降低，但不同有機物料對豐富度和多樣性影響的程度不同，YG處理的Chao1指數(shù)、ACE、Observed species和Shannon指數(shù)降幅最大，CP處理次之，而MK、JG和GZ處理的土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性與CK1相當(dāng)，但又明顯低于CK。

2.4.2? 添加不同有機物料處理的ASD對土壤細(xì)菌群落物種構(gòu)成的影響? 不同處理細(xì)菌群落在門水平的相對豐度如圖3所示。各處理豐度前10的細(xì)菌門類均為厚壁菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、疣微菌門、芽單胞菌門，表明厭氧消毒及添加有機物料并不會改變細(xì)菌的門類，但是可以明顯改變優(yōu)勢種群的比例。與CK相比，ASD處理的厚壁菌門相對豐度顯著增加，其中YG與CP處理的厚壁菌門增加尤為明顯，較CK分別增加了24和23倍。而變形菌門、綠彎菌門和放線菌門的相對豐度卻顯著降低。此外，YG與CP處理下的酸桿菌門的相對豐度顯著下降。

對厚壁菌門微生物進(jìn)一步分析表明（圖4），梭菌科、瘤胃菌科和芽孢桿菌科3個科的細(xì)菌變化幅度最大，ASD處理后此3科細(xì)菌的相對豐度較CK都有不同程度的增加，其中YG和CP處理的3科細(xì)菌相對豐度顯著增加，MK和GZ處理的瘤胃菌科和梭菌科細(xì)菌的相對豐度顯著增加，而JG處理只有瘤胃菌科細(xì)菌相對豐度顯著增加，但JG處理的梭菌科細(xì)菌的相對豐度明顯小于CK1。

2.4.3? 添加不同有機物料ASD后細(xì)菌微生物的非度量多維尺度分析? 從圖5可知，CK1和不同有機物料處理的細(xì)菌微生物構(gòu)成與CK之間差異較大，其中YG和CP的微生物構(gòu)成與CK、CK1差異較大。此外，MK與GZ的處理幾乎重合，說明MK與GZ的微生物構(gòu)成較相似。

2.5? 土壤厭氧消毒對土壤青枯菌數(shù)量的影響

由圖6可知，與CK相比，添加有機物料的厭氧消毒顯著降低了土壤中可培養(yǎng)青枯菌數(shù)量，降低幅度為63.6%～81.7%，其中YG和CP處理降幅最大，而單純的厭氧處理土壤中可培養(yǎng)青枯菌含量與CK無顯著差異。

3? 討? 論

3.1? 土壤厭氧消毒對土壤理化特性的影響

水旱輪作是一種歷史悠久、有效控制土傳病害的措施，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。但是黃新琦等發(fā)現(xiàn)由于缺乏營養(yǎng)，土壤中的厭氧微生物代謝活動較慢，單純的淹水并不能有效地抑制土傳病害。ASD通過添加有機物料和厭氧發(fā)酵，能在短時間內(nèi)顯著改變土壤理化性質(zhì)。本研究ASD處理均使土壤pH顯著增加，土壤Eh顯著降低，這結(jié)果與以往研究基本一致。但本研究發(fā)現(xiàn)不同有機物料使土壤pH上升、Eh下降的幅度存在顯著差異，這表明不同有機物料可使土壤處于不同的厭氧還原狀態(tài)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)添加YG的ASD處理EC值沒有變化，而其他處理的土壤EC值卻顯著降低，這一結(jié)果與伍朝榮等研究結(jié)果恰好相反，造成這種差異的原因可能與不同有機物料添加后ASD處理過程中微生物驅(qū)動不穩(wěn)定碳源將離子轉(zhuǎn)化為氣體從而使EC值降低有關(guān)。

土壤厭氧消毒處理過程中，添加的有機物料經(jīng)礦化降解可顯著增加土壤養(yǎng)分含量。本研究結(jié)果表明ASD處理的土壤有機質(zhì)、全氮、速效氮含量顯著高于對照，CP處理尤為明顯，這結(jié)果與顧志光等的研究相似。究其原因可能與菜粕是一種高氮物料，分解時會釋放大量的氮有關(guān)。而添加YG的ASD土壤的速效鉀含量顯著升高，這與煙梗中含有大量的鉀有關(guān)。此外，本研究ASD可以明顯增加土壤有效磷的含量，在分解能源物質(zhì)過程中，添加有機物料的ASD可以提高微生物對土壤有效磷的保護(hù)，減少磷的吸附和固定，從而增加磷的有效性。

3.2? 土壤厭氧消毒對土壤酶活的影響

菜粕在土壤中極易分解，為土壤提供了大量的有機碳源和氮源，促進(jìn)了土壤微生物的活性，從而提高了土壤脲酶的活性。土壤過氧化氫酶活性與土壤有機質(zhì)含量有關(guān)，也與微生物數(shù)量有關(guān);土壤蔗糖酶活性則與土壤微生物數(shù)量及呼吸強度有直接關(guān)系。因此，本研究表明添加CP的ASD處理使土壤脲酶和過氧化氫酶活性顯著增加，而添加JG和MK的ASD可提高土壤蔗糖酶活性，上述酶活性變化有益于土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，從而改善土壤營養(yǎng)與健康質(zhì)量。

3.3? 土壤厭氧消毒對土壤細(xì)菌微生物群落的影響

ASD能在短時間內(nèi)形成厭氧、強還原性、高溫等環(huán)境，并能產(chǎn)生揮發(fā)性氣體、有機酸、低價重金屬等各類有毒物質(zhì)，惡劣的土壤環(huán)境導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化。本研究ASD處理可顯著增加厚壁菌門的相對豐度，降低變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，使土壤青枯菌數(shù)量顯著減少，5種有機物料間存在一定差異，以YG和CP兩處理微生物構(gòu)成與CK、CK1差異更大。引發(fā)煙草青枯病的茄科雷爾氏菌屬于變形菌門，添加YG與CP處理的變形菌門的豐度下降幅度最大，這表明YG和CP處理抑制了變形菌門的茄科雷爾氏菌，這一結(jié)果與MOWLICK等研究相似。本研究還發(fā)現(xiàn)YG和CP處理的厚壁菌門相對豐度增加最多，且其門下的瘤胃菌科和梭菌科、芽胞桿菌科細(xì)菌的相對豐度也顯著升高。UEKI等從ASD處理中分離到梭菌屬的兩株厭氧型菌株（H110和TB8）能破壞鐮刀菌細(xì)胞壁，達(dá)到致死該病原菌的作用。何玉安等研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬的LSN02和LLGJ04菌株均能對青枯菌產(chǎn)生明顯的抑制作用。這表明本研究中YG和CP處理下厚壁菌門相對豐度的增加可能對青枯菌產(chǎn)生一定抵制作用，但仍需進(jìn)一步驗證。酸桿菌門是土壤微生物的重要成員，在土壤物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)環(huán)境構(gòu)建過程中起到非常重要的作用，酸桿菌絕對含量與土壤有機質(zhì)含量呈正相關(guān)，而與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。添加YG和CP的土壤pH顯著升高，酸桿菌門相對豐度顯著降低，這與酸桿菌門細(xì)菌的特性相一致。由此可知，添加不同有機物料的ASD處理的微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，但是優(yōu)勢群落厚壁菌門相對豐度的增加總體趨勢一致，尤以YG和CP兩處理增加明顯，促進(jìn)厭氧型和耐受型等細(xì)菌生長，抑制包括病原菌等其他細(xì)菌群落生長，從而達(dá)到控制土傳病害的效果。值得注意的是，本研究ASD法產(chǎn)生的極端環(huán)境對好氧有益細(xì)菌也有一定抑制作用，但不會完全殺死，在后期種植過程中有益菌種群會得到恢復(fù)。

4? 結(jié)? 論

本研究表明表明，添加不同有機物料的ASD處理對植煙土壤的理化性狀和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生不同程度的影響，各有機物料處理間差異顯著，其中添加菜粕和煙梗的ASD可以顯著提高土壤pH、EC、有機質(zhì)、全氮和速效氮，顯著改變細(xì)菌微生物多樣性，厭氧菌和耐受型細(xì)菌豐度明顯升高，青枯菌數(shù)量顯著降低。此外，本文參照以往研究只用了一種添加劑量，對有機物料不同添加劑量的ASD效果有待進(jìn)一步，研究煙梗作為有機物料時要防止其帶有花葉病毒。

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