戚瑞敏，溫延臣，趙秉強(qiáng)，林治安，李志杰，李 娟

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

氮是地球上最豐富的化學(xué)元素和植物生長必需的營養(yǎng)元素之一。氮循環(huán)是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中最基本的物質(zhì)循環(huán)過程，對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、生產(chǎn)力及其環(huán)境效應(yīng)具有關(guān)鍵性的作用[1-2]。施肥是影響土壤質(zhì)量演化及其可持續(xù)利用最為深刻的農(nóng)業(yè)措施之一[3]，長期施肥不僅能夠提高土壤供氮能力，還能穩(wěn)定土壤氮庫，促進(jìn)土壤“供氮、保氮”，使進(jìn)入土壤中的氮迅速轉(zhuǎn)化為土壤的活性氮庫和穩(wěn)定氮庫[4-5]。土壤活性有機(jī)質(zhì) (微生物量、可溶性有機(jī)質(zhì)及顆粒有機(jī)質(zhì)) 中的氮組分，即微生物量氮 (MBN)、可溶性有機(jī)氮 (DON) 和顆粒有機(jī)氮 (PON) 被認(rèn)為是土壤活性氮庫中的重要組分，在土壤氮循環(huán)過程中起著非常重要的作用[6-9]。了解長期不同施肥土壤活性有機(jī)氮庫組分來源及外源碳添加對其參與土壤氮循環(huán)的動態(tài)轉(zhuǎn)化過程及特征尤為重要。

土壤有機(jī)氮庫是土壤氮庫的主要存在形式，約占土壤氮庫的85%，是土壤氮素的主體與作物必需氮素的主要來源[10]，主要受土壤質(zhì)地和類型、種植制度、農(nóng)藝方式 (耕作、施肥、灌溉等) 及氣熱條件等環(huán)境因素的影響，外界環(huán)境因素不同，土壤生態(tài)系統(tǒng)有機(jī)氮庫的動態(tài)平衡不同，其各組分的物理、化學(xué)性質(zhì)和對作物的有效性也不同[4,8,11-12]。土壤有機(jī)氮庫組分是土壤有機(jī)氮的重要化學(xué)形態(tài)，按照提取方法 (物理、化學(xué)、生物)、組成成分及活性程度不同，有不同的定義與分級[13]。國內(nèi)外常用的土壤有機(jī)氮的分級是Bremner1965年提出的方法，主要根據(jù)土壤有機(jī)氮的化學(xué)形態(tài)組成成分將有機(jī)氮分為氨態(tài)氮、氨基酸態(tài)氮、氨基糖態(tài)氮、酸解未知氮和酸不溶氮，且對不同生境條件及農(nóng)藝措施對土壤有機(jī)氮分級特征的影響進(jìn)行了廣泛研究[9,14-16]。近些年，有研究根據(jù)物理-化學(xué)分組方法將土壤有機(jī)氮分為未保護(hù)游離態(tài)顆粒、物理保護(hù)、化學(xué)保護(hù)及生物化學(xué)保護(hù)有機(jī)氮組分[17-18]并進(jìn)行了深入研究[19-20]。根據(jù)活性程度不同，土壤有機(jī)氮庫可分為活性有機(jī)氮庫與惰性有機(jī)氮庫[5,21-22]；而活性有機(jī)氮組分中，顆粒有機(jī)氮 (PON)、可溶性有機(jī)氮 (DON)、輕組有機(jī)氮(LFON) 以及微生物量氮 (MBN) 被認(rèn)為是土壤活性氮庫中的重要組成成分[7,23]。國內(nèi)外對不同生態(tài)系統(tǒng)土壤有機(jī)氮庫單個組分研究較多[22]，但僅限于單個組分“數(shù)量”或“含量”的研究，而對不同生境條件下土壤活性氮庫組分的系統(tǒng)研究較少，對其參與土壤氮循環(huán)過程中調(diào)控機(jī)制的“質(zhì)”方面的研究更少[15,24]。前人研究表明，土壤可溶性有機(jī)氮及提取態(tài)有機(jī)氮參與了土壤氮礦化過程，且動態(tài)轉(zhuǎn)化過程一致，對土壤氮礦化起著重要作用[9,25]，農(nóng)田土壤中，DON占土壤全氮的0.15%～0.19%[26]，雖然土壤可溶性氮在土壤全氮中的占比很小，但是卻被認(rèn)為是參與動態(tài)變化及生物可利用礦質(zhì)氮源中最重要的部分[27]；有機(jī)肥、秸稈還田等措施增加了土壤可溶性氮及提取態(tài)有機(jī)氮含量[25]。顆粒態(tài)有機(jī)氮 (PON) 占土壤氮的比例主要在1.5%～10.0%[28]，其短期內(nèi)動態(tài)變化能夠反映土壤氮循環(huán)特性[29-30]。15N標(biāo)記秸稈示蹤研究表明，PON的礦化是農(nóng)業(yè)土壤礦質(zhì)氮的主要來源，礦化速率受作物秸稈的C/N比及土壤特性等影響[9]。Hurisso等[31]的研究表明，由長期耕作導(dǎo)致的土壤活性氮的退化單靠免耕是不能恢復(fù)的，指出需通過外源物添加提高土壤活性有機(jī)氮庫。

土壤有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化主要是土壤微生物及其分泌的酶共同作用的結(jié)果[32]，因此，對土壤酶參與有機(jī)氮礦化的生物學(xué)機(jī)制的深入了解有利于從本質(zhì)上認(rèn)識不同土壤有機(jī)氮礦化差異的來源。大量研究表明，施肥尤其是施用有機(jī)肥能直接或間接地影響土壤酶活性[33-34]。前期研究結(jié)果表明，與不施肥相比，施用有機(jī)肥能顯著增加土壤水解酶[α-葡萄糖苷酶 (AG)、β-葡萄糖苷酶 (BG)、β-木糖苷酶 (BXYL)、纖維二糖水解酶 (CBH) 和磷酸酶 (PHOS) ]活性，卻顯著降低了土壤酚氧化酶 (phenox) 活性，且施用有機(jī)肥對土壤酶活性的影響隨有機(jī)肥施用量的增加而增加[35]。長期不同施肥土壤中有機(jī)氮庫和酶活性不同，其對添加外源有機(jī)物的響應(yīng)不同，參與外源有機(jī)物分解轉(zhuǎn)化的過程及其調(diào)控機(jī)制也有所不同。因此，本研究以始建于1986年的長期定位施肥試驗(yàn)為平臺，通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)研究添加牛糞條件下，不同施肥制度潮土活性有機(jī)氮庫及酶活性變化特征，揭示不同施肥潮土活性有機(jī)氮庫對牛糞的響應(yīng)機(jī)制，為提升土壤肥力，維持土壤生態(tài)平衡和改善土壤生物學(xué)特性提供理論依據(jù)，對于實(shí)現(xiàn)資源利用及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

供試土壤采自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院德州實(shí)驗(yàn)站禹城試驗(yàn)基地的有機(jī)無機(jī)配比長期定位試驗(yàn) (建于1986年10月)，該試驗(yàn)地位于華北平原東部 (東經(jīng)116°34′、北緯 36°50′)，光熱資源豐富，太陽輻射總量5225 MJ/m2，年日照時數(shù)2640 h，≥ 0℃積溫4951℃，≥ 10℃積溫4441℃，年平均氣溫13.1℃；雨熱同期，年平均降雨量570 mm，水面蒸發(fā)量2094 mm，無霜期206天；屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候。試驗(yàn)地的土壤類型為潮土，成土母質(zhì)為黃河沖積物，耕層質(zhì)地輕壤 (黏粒含量21.4%，粉粒含量65.6%，砂粒含量3.0%)；初始土壤 (0—20 cm) (1986年) 的基本理化性狀分別為：有機(jī)碳3.93 g/kg，全氮0.51 g/kg，有效氮37.5 mg/kg，速效磷7.5 mg/kg，速效鉀73.0 mg/kg，陽離子交換量15.8 cmol/kg，水溶性鹽含量0.96 mg/kg，pH值8.56。主要種植制度為冬小麥-夏玉米一年兩熟制。試驗(yàn)設(shè)6個處理，本研究選取其中的4個處理，分別為：1) 不施肥 (對照，CK)；2) 常量有機(jī)肥 (OF，有機(jī)養(yǎng)分年施用N 375～450 kg/hm2；P、K按照有機(jī)肥氮量進(jìn)行折算)；3) 常量化肥 (CF，年施用N 375～450 kg/hm2、P2O5225～300 kg/hm2、K2O 150 kg/hm2)；4) 常量有機(jī)無機(jī)配施 (1/2有機(jī)肥 + 1/2化肥，OCF)。常量有機(jī)肥與化肥處理的年養(yǎng)分投入量相同，每個處理重復(fù)4次，小區(qū)之間用0.8 m的水泥擋板隔開，小區(qū)面積28 m2(4 m × 7 m)。具體作物品種、肥料性質(zhì)、施肥措施及小區(qū)試驗(yàn)設(shè)計詳見Li等[36]的研究。

土壤樣品于2014年10月玉米收獲后取樣，每個小區(qū)隨機(jī)選取5～10個點(diǎn)，用土鉆 (3 cm) 取0—20 cm的土樣混勻，裝好用冰盒立即帶回實(shí)驗(yàn)室并迅速測定土壤樣品含水量。將土壤樣品分成兩部分，一部分風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)的測定；另一部分過2 mm篩并存于4℃，用于后續(xù)的室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)。其理化性質(zhì)見表1。

選取對照 (CK) 和三個常量施肥處理 (OF、CF、OCF) 共16個土壤樣品進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)。稱取相當(dāng)于100 g干土重的鮮土 (培養(yǎng)前將土壤含水量調(diào)至田間含水量的60%) 于250 mL培養(yǎng)瓶中分別進(jìn)行不添加 (M0) 和添加牛糞 (M1) 兩個處理的培養(yǎng)試驗(yàn)，同時用不添加土壤的培養(yǎng)瓶作為對照，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)79天，每個土壤樣品設(shè)2個重復(fù)，定期打開培養(yǎng)瓶塞通氣，使瓶內(nèi)氣體與大氣進(jìn)行充分交換，同時用稱重法調(diào)節(jié)土壤含水量使其保持田間含水量的60%。在培養(yǎng)第25天及79天時，取出土樣保存于4℃下用于土壤全氮及活性有機(jī)氮庫組分的測定分析，并測定第79天土壤酶活性。

表1 2014年玉米收獲后各處理土壤化學(xué)性狀Table 1 Chemical properties of soils in each treatment after maize harvest in 2014

牛糞選用2014年禹城當(dāng)?shù)匦竽琉B(yǎng)殖場腐熟牛糞，主要養(yǎng)分含量為碳 (C) 21.5%、氮 (N) 1.67%、磷(P2O5) 2.68%、鉀 (K2O) 1.57%，碳氮比 (C/N) 為12.88，牛糞的施用量按與長期定位施肥中常量化肥施氮量等量折算，為每kg干土施N 0.2 g。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 土壤全氮 采用凱氏定氮法。土樣經(jīng)濃硫酸消煮后，再將堿化蒸餾出來的氨用硼酸吸收，以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，求土壤全氮含量。

1.2.2 微生物量氮 (MBN) 土樣經(jīng)氯仿熏蒸-K2SO4浸提后，用TOC/N自動分析儀 (Multi N/C?205 3100，德國耶拿) 測定。稱取預(yù)培養(yǎng)后的新鮮土壤于小燒杯中，將其置于真空抽濾器中用去乙醇氯仿在25℃的培養(yǎng)箱中避光熏蒸24 h。然后反復(fù)抽濾幾次以去除氯仿，將熏蒸的土壤樣品用0.5 mol/L K2SO4溶液振蕩浸提，與此同時以相同的方法提取未熏蒸的土壤，浸提液用TOC/N自動分析儀 (Multi N/C ?205 3100，德國耶拿) 測定。微生物量氮計算公式：BN= EN/KEN。其中，EN為熏蒸和未熏蒸土壤的差值；KEN為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.45[38-39]。

1.2.3 可溶性有機(jī)氮 (DON) 0.5 mol/L K2SO4提取法-TOC/N自動分析儀 (Multi N/C ?205 3100，德國耶拿) 測定。

稱取相當(dāng)于10 g干土的鮮土于125 mL的塑料瓶中，加入50 mL 0.5 mol/L K2SO4，在往復(fù)振蕩機(jī)中振蕩 (250 r/min) 提取1 h，然后2500 r/min離心15 min，上清液通過真空泵抽濾過0.45 μm的濾膜后，用TOC/N自動分析儀 (Multi N/C ?205 3100，德國耶拿) 測定其DON含量[40-41]。

1.2.4 顆粒態(tài)有機(jī)氮 (PON) 采用5 g/L六偏磷酸鈉提取法測定。稱取過2 mm篩的風(fēng)干土10 g于125 mL的塑料瓶中，加入30 mL 5 g/L的六偏磷酸鈉溶液，在往復(fù)振蕩機(jī)中振蕩18 h (90 r/min)，分散。分散液置于53 μm的篩上，用蒸餾水沖洗至濾液澄清。將篩上53～2000 μm的土樣沖洗至燒杯中，60℃烘干至恒重，計算其占整個土壤樣品的百分比，并測定烘干樣品中的全氮含量，將烘干樣品中的土壤全氮含量換算成整個土壤樣品的對應(yīng)的顆粒態(tài)氮組分含量[42]。

1.2.5 土壤酶活性的測定 熒光微孔板酶活性分析法能夠在短時間內(nèi)測定大批量的土壤樣品和多種酶活性，近年來被廣泛應(yīng)用于不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤酶活性研究中[37]。本研究中，測定了參與土壤碳氮磷循環(huán)的7種土壤酶活性，其中包括α-葡萄糖苷酶 (α-1,4-glucosidase，AG)、β-葡萄糖苷酶 (β-1,4-glucosidase，BG)、β-木糖苷酶 (β-1,4-xylosidase，BXYL)、纖維二糖水解酶 (cellobiohydrolase，CBH)和磷酸酶 (phosphatase，PHOS) 5種水解酶及過氧化物酶 (peroxidase，perox) 和酚氧化酶 (phenol oxidase，phenox) 2種氧化還原酶。

利用黑色微孔板測定了7種水解酶活性，并根據(jù)DeForest[43]的研究方法，對使用的緩沖液稍作調(diào)整。具體步驟如下：稱取相當(dāng)于1.0 g干土重的鮮土于200 mL的塑料瓶中，加入125 mL去離子水作為緩沖液，在振蕩機(jī)上振蕩30 min，制成均質(zhì)泥漿。然后用排槍加200 μL土壤懸浮液于96孔微孔板中(每個樣品做8個平行)，整個過程需用磁力攪拌器攪勻土壤懸浮液。樣品分析孔中加入200 μL土壤懸浮液和50 μL底物溶液；陰性對照孔中加入200 μL緩沖液和50 μL底物溶液；樣品對照孔中加入200 μL土壤懸浮液和50 μL緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)孔中加入200 μL緩沖液和50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液 (10 mmol/L的4-甲基傘形酮)；淬火對照孔中加入200 μL土壤懸浮液和50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液。將微孔板于25℃黑暗條件下培養(yǎng)4小時，隨后用酶標(biāo)儀 (Scientific Fluoroskan Ascent FL，Thermo) 檢測熒光值，檢測的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為365 nm和450 nm。土壤酶活性[nmol/(g·h)]用單位時間內(nèi)每克土樣轉(zhuǎn)化底物的nmol數(shù)表示。

過氧化物酶、酚氧化酶活性用L-DOPA作為底物在白色微孔板中進(jìn)行測定[43-44]?？瞻讓φ湛字屑尤?50 μL緩沖液；陰性對照孔中加入200 μL緩沖液和50 μL的L-DOPA溶液 (濃度為25 mmol/L)；樣品對照孔中加入200 μL土壤懸浮液和50 μL緩沖液；樣品分析孔中加入200 μL土壤懸浮液和50 μL的L-DOPA溶液。對于過氧化物酶活性的分析，每個孔中均需加入10 μL 0.3%的雙氧水。將白色微孔板置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)20 h，隨后用酶標(biāo)儀在450 nm的波長下測定吸光度，其活性用μmol/(g·h) 表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin8作圖，分析土壤活性有機(jī)氮組分的變化特征；用Canoco5進(jìn)行冗余分析，研究土壤酶活性與活性有機(jī)氮庫組分之間的關(guān)系；采用Excel 2013及SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，LSD法檢驗(yàn)差異顯著性 (P ＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥制度土壤活性有機(jī)氮庫的變化特征

土壤活性有機(jī)質(zhì)中的氮組分作為土壤活性氮庫中的重要組成成分，受施肥的影響較大。長期施肥28年后，與長期施化肥 (CF) 及不施肥處理 (CK) 相比，長期施有機(jī)肥 (OF) 能顯著提高土壤活性有機(jī)氮庫組分 (MBN、DON和PON) 含量，長期施化肥處理 (CF) 效果不及長期施有機(jī)肥 (OF) 及有機(jī)無機(jī)配施處理 (OCF)，OCF中的DON含量最高，CK和OF中MBN的含量差異不顯著 (圖1)，這與本課題組之前報道一致[5]。這說明施肥有利于土壤活性氮的儲存，特別是PON的含量，有利于提高土壤的供氮能力。研究表明，長期施肥土壤活性氮庫組分(MBN、DON和PON) 與土壤全氮含量之間均呈顯著性正相關(guān)，且活性有機(jī)氮庫組分相互之間也顯著正相關(guān) (表 2)。

2.2 牛糞對不同施肥土壤有機(jī)氮庫的影響

由圖1可以看出，培養(yǎng)期間，土壤TN及PON含量變化趨勢在各處理中均為：OF ＞ OCF ＞ CF ＞CK (P ＜ 0.05)；OF處理中無論添加牛糞與否，TN及PON含量均隨著時間的延長呈先降低后逐漸平穩(wěn)趨勢 (圖1)；在不添加牛糞情況下，除OF處理的PON含量顯著下降外 (P ＜ 0.05)，CF，OCF和CK處理的PON含量隨培養(yǎng)時間的延長變化不顯著；與不添加牛糞相比，添加牛糞顯著增加了OCF、CF及CK處理中TN及PON含量 (P ＜ 0.05)。

除OCF處理外，其他施肥處理土壤MBN含量隨培養(yǎng)時間延長均為先增加再降低的趨勢；OCF處理中土壤MBN含量隨培養(yǎng)時間延長逐漸降低。不添加牛糞處理的CF和CK處理土壤MBN含量始終顯著高于添加牛糞處理 (P ＜ 0.05)，但添加牛糞情況下，OF和OCF處理土壤MBN含量在培養(yǎng)第25天均大于不添加牛糞處理，在第79天時，MBN含量均顯著低于不添加牛糞處理 (P ＜ 0.05) (圖1)。無論添加牛糞與否，各施肥處理土壤DON含量隨培養(yǎng)時間延長均呈上升趨勢；培養(yǎng)期間，除OF外，其他處理DON含量均為添加牛糞的處理與不添加牛糞處理的相當(dāng) (第25天) 或者高于不添加牛糞處理 (第79天)，而OF處理的DON含量表現(xiàn)為在第25天，不添加牛糞處理的顯著高于添加牛糞處理，而到第79天，添加牛糞的處理又高于不添加牛糞的處理。

連續(xù)培養(yǎng)25天，與不添加牛糞相比，添加牛糞顯著增加了各處理土壤TN及PON含量，對CK及CF處理的作用效果顯著高于OF及OCF處理；除CF處理外，較不添加牛糞相比，添加牛糞顯著降低了其他處理的DON含量；相反，添加牛糞顯著增加了OF及OCF處理MBN含量，而顯著降低了CK及CF處理含量 (圖2)。

培養(yǎng)79天后，與不添加牛糞相比，添加牛糞顯著增加了各處理土壤TN、DON及PON組分含量，分別提高了5.43%～15.49%、5.83%～69.42%和19.75%～42.29%。圖2顯示，添加牛糞對CK及長期施用化肥處理 (CF) 的影響比對長期施有機(jī)肥處理(OF、OCF) 的影響明顯。但添加牛糞顯著降低了土壤MBN含量，降低幅度為16.91%～62.10%，且對長期施有機(jī)肥處理 (OF、OCF) 的影響顯著大于對CK及CF的影響。

圖 1 好氣培養(yǎng)下添加牛糞對長期不同施肥土壤全氮及活性有機(jī)氮庫組分含量的影響Fig. 1 Dynamic changes of soil total N and labile organic nitrogen fractions in soils under different fertilizer patterns during incubation

表2 長期不同施肥土壤活性有機(jī)氮庫組分之間及其與土壤全氮含量間相關(guān)性分析 (P值)Table 2 Correlation analysis between soil total nitrogen and labile organic nitrogen fractions (P value)

2.3 牛糞對不同施肥制度下土壤酶活性的影響

表3分析表明，施肥、添加牛糞及其交互作用對土壤酶活性具有顯著影響 (P＜ 0.05)。

為明確不同施肥處理下土壤酶活性的變化規(guī)律，計算了添加與不添加牛糞處理的土壤酶活性的百分比差異 (圖3)，無論添加牛糞與否，三個施肥處理土壤過氧化物酶和酚氧化酶活性顯著低于對照土壤，水解酶活性卻呈現(xiàn)不同的變化趨勢。不添加牛糞培養(yǎng)，CF處理土壤β-木糖苷酶 (BXYL) 和β-纖維素酶 (CBH) 分別提高了209%和181%。添加牛糞培養(yǎng)，OF處理土壤β-葡萄糖苷酶 (BG) 和β-纖維素酶(CBH) 分別提高了201%和308%。

2.4 添加牛糞土壤有機(jī)氮庫與酶活性之間的相關(guān)性分析

將不同施肥制度土壤的TN、MBN、DON、PON和SOC/TN (C/N) 作為自變量 (解釋變量)，土壤酶活性作為因變量 (響應(yīng)變量)，分別進(jìn)行了添加和不添加牛糞條件下的冗余分析 (redundancy analysis，RDA)。在不添加牛糞時 (圖4)，解釋變量可解釋模型的48.30%，軸1和軸2分別占36.95%和9.08%。施肥處理 (CF、OF、OCF) 的組群與CK處理顯著分離，分別在軸的正反兩方向上，并且不同施肥處理也顯著分開。預(yù)選 (forward-selection) 結(jié)果表明，DON是影響土壤酶活性變化的重要影響因素，可以解釋總變量的34.40% (P＜ 0.01)，這可能是造成不同施肥處理之間分異的主要原因。

圖 2 不同施肥處理土壤添加牛糞培養(yǎng)后全氮及有機(jī)氮組分含量的相對變化Fig. 2 Relative change of total N and organic N fractions affected by cattle manure addition in soils under different fertilization patterns

表3 施肥、添加牛糞對土壤酶活性變化的影響 (培養(yǎng)第79天)Table 3 Effect of fertilization pattern and manure addition on soil enzyme activities (Incubating 79 days)

在添加牛糞的RDA模型中 (圖4)，解釋變量占總變量的80.50%，軸1和2的特征根分別解釋了變異的56.85%和18.89%。OF、OCF處理與和CK、CF處理分離顯著，分別在軸的正反兩個方向上。OF與OCF之間以及CK和CF處理之間均有明顯的分離。預(yù)選結(jié)果顯示TN和DON是添加牛糞時較好的解釋變量因子，能分別解釋土壤酶活性變異的56.48% (P＜ 0.01) 和 18.28% (P＜ 0.01)。

整體來看，預(yù)選模型表明，在土壤全氮和活性有機(jī)氮庫組分這些環(huán)境因子中，添加與不添加牛糞下土壤酶活性的關(guān)鍵驅(qū)動因子不同，不添加牛糞條件下可溶性有機(jī)氮DON為主要影響因子，添加后其關(guān)鍵影響因子為全氮TN和可溶性有機(jī)氮DON。

圖 3 添加牛糞對各施肥處理土壤酶活性的影響Fig. 3 Effect of cattle manure addition on the enzyme activities of soils from different fertilization patterns

圖 4 不同施肥制度土壤酶活性和全氮及有機(jī)氮庫組分之間的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of soil enzyme activities constrained by TN and organic nitrogen fractions in soils from different fertilization regimes after 79 days of incubation

3 討論

土壤可溶性有機(jī)氮被用作土壤供氮能力的評價指標(biāo)及施肥等農(nóng)藝措施對土壤變化影響的生物指示指標(biāo)[45]。探討土壤全氮中隨時間變化的活性部分，如土壤微生物量氮，能較好地反映由于固定-礦化過程而改變養(yǎng)分有效性動力的土壤質(zhì)量和生產(chǎn)能力[46-47]，還能較好地估計由于管理措施而引起的氮素礦化潛力變化[48-49]。顆粒態(tài)有機(jī)氮 (PON) 被認(rèn)為是處于活性和慢性氮組分之間的中間體，也會隨著土壤管理措施的改變作出迅速的響應(yīng)[48]。

我國區(qū)域廣闊，各地分布了多個長期定位實(shí)驗(yàn)，涵蓋了全國不同的土壤類型、氣熱條件及種植制度。目前為止，已有不少關(guān)于不同施肥類型及水平對土壤有機(jī)氮庫影響的研究工作，可以總結(jié)為：長期施肥均能顯著增加土壤微生物量氮[50-53]、耕層顆粒有機(jī)氮含量及儲量[54]。黃威等[8]以湖南3個長期定位試驗(yàn)點(diǎn)為研究對象，指出長期單施化肥、單施有機(jī)肥及有機(jī)無機(jī)配施均能提高紅壤活性有機(jī)氮含量，且隨有機(jī)肥施用量的增加而增加；土壤活性氮與全氮的積累速率呈極顯著相關(guān)。不同種植制度下，北京褐潮土區(qū)長期撂荒土壤微生物量氮含量顯著高于農(nóng)田土壤[50]，且在農(nóng)田土壤中，長期輪作的土壤微生物量氮含量要高于長期連作的；韓曉日等[55]指出施有機(jī)肥對黑土土壤微生物量氮貢獻(xiàn)大，施化肥對土壤微生物量氮的貢獻(xiàn)較小，土壤氮是微生物量氮的主要來源，有機(jī)無機(jī)配施介于二者之間。本課題組以往研究[5]表明，長期施用有機(jī)肥顯著提高了黃淮海潮土土壤全氮、土壤微生物量氮、可溶性有機(jī)氮和顆粒有機(jī)氮含量，且土壤全氮及其活性氮組分的含量隨有機(jī)肥或化肥施用量的增加而增加。顆粒態(tài)氮占土壤全氮的比例最高，為6.6%～18.6%；其次為微生物量氮，為6.8%～8.8%；可溶性有機(jī)氮占比最低。這表明，施肥措施不同，對土壤有機(jī)氮庫組分含量影響及肥料在有機(jī)氮庫組分中的分配不同[13]。本研究中，微生物量氮、可溶性有機(jī)氮和顆粒有機(jī)氮與土壤全氮表現(xiàn)出一致的趨勢，均隨著有機(jī)肥施入量的增加而增加，與前人結(jié)果相似[50]。有機(jī)氮積累過程中，有機(jī)肥主要進(jìn)入土壤顆粒態(tài)氮庫[5]，而化肥可提高土壤微生物量氮在土壤氮庫中的百分比[55]。

本研究表明，培養(yǎng)時間及外源有機(jī)物料對長期不同施肥土壤活性有機(jī)氮庫組分的影響也差異顯著，影響程度取決于氮源和碳源 (能源) 的供應(yīng)強(qiáng)度。添加新鮮的有機(jī)物料后，土壤碳源充足，激發(fā)了土壤微生物的大量生長，生物量氮增加，但當(dāng)新鮮有機(jī)物料被消耗到一定程度后，微生物能利用的易分解有機(jī)碳源已耗盡，很快轉(zhuǎn)入利用較難分解的有機(jī)碳，生物量氮下降，呈現(xiàn)周期性的變化 (圖1)[56]。除土壤微生物量氮外，其他土壤活性氮組分普遍呈現(xiàn)隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加趨勢，說明土壤微生物在分解有機(jī)物料的同時，也分解土壤有機(jī)質(zhì)，轉(zhuǎn)化為PON，釋放出DON，從而增加了土壤全氮含量。

土壤肥力不同，有機(jī)物料對土壤活性有機(jī)氮庫含量的影響也不相同。本研究中，培養(yǎng)結(jié)束后，添加牛糞對長期施用有機(jī)肥土壤的影響效果不及其對長期施化肥及不施肥處理的影響。這與李世清等[14]研究的結(jié)果一致，他們認(rèn)為土壤肥力不同，有機(jī)物料對土壤微生物量氮的影響效果不同，有機(jī)物料在低肥力土壤上的效果更加突出。胡瑋等[57]關(guān)于不同碳氮比有機(jī)物料對土壤肥力的影響研究表明，碳氮比為12.5的有機(jī)物料配比更有利于提高低肥力土壤微生物量氮的含量，這與我們的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，添加牛糞后，長期不施肥與施化肥處理土壤微生物量氮含量顯著低于相同處理不添加牛糞的土壤微生物量氮含量，說明在一定的條件下，牛糞限制了土壤氮向微生物量氮的轉(zhuǎn)化，且刺激了土壤微生物量氮向其他氮庫的遷移和轉(zhuǎn)化 (圖1)。這與韓曉日等[55]研究結(jié)果一致，指出單施有機(jī)肥降低了土壤微生物量氮來自土壤氮的百分比，這可能與添加牛糞提高了土壤C/N有關(guān)。

土壤酶作為土壤生物活性及土壤肥力的重要組成部分，在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量的轉(zhuǎn)化中起著重要的催化作用，其活性可快速反映施肥對土壤肥力和土壤質(zhì)量的影響[58-59]。本研究表明，長期施肥對土壤酶活性影響很大。對于土壤α-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶BXYL、β-纖維素酶CBH和磷酸酶PHOS總體趨勢是施肥的高于不施肥的。施肥之所以能提高土壤酶活性這是因?yàn)槭┓士纱龠M(jìn)作物根系代謝，使根系分泌物增多，微生物繁殖加快，從而有利于提高土壤酶活性[60]。對長期施肥土壤酶活性進(jìn)行meta分析表明，施肥提高了土壤中與有機(jī)質(zhì)分解相關(guān)酶(BG和NAG) 的活性，但對與氮循環(huán)相關(guān)的亮氨酸氨基肽酶 (LAP) 活性無顯著影響。原因主要為，施有機(jī)肥或化肥直接或間接增加了碳源，促進(jìn)微生物活動，加速土壤碳循環(huán)，提高了土壤中與有機(jī)質(zhì)分解相關(guān)酶 (BG和NAG) 的活性[61]。但是，長期施肥卻降低了土壤酚氧化酶和過氧化物酶的活性。這與孫瑞蓮等[62]報道類似，但與高瑞等[60]報道相反。這一結(jié)果可能與土壤類型、氣候條件、種植制度等不同有關(guān)。

有研究表明，可溶性有機(jī)態(tài)氮對堿性磷酸酶和蔗糖酶活性有顯著影響[63-64]，且土壤氮元素的富集減少了過氧化物酶基因的表達(dá)量[65]，與我們的研究結(jié)果，即土壤全氮和可溶性有機(jī)氮與土壤酶活性有極強(qiáng)的相關(guān)性一致。這說明土壤酶活性的變化與土壤養(yǎng)分的變化之間有直接的關(guān)系。土壤酶參與土壤中復(fù)雜的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過程，研究結(jié)果中各酶活性之間極強(qiáng)的相關(guān)性說明土壤中進(jìn)行酶促反應(yīng)的各土壤酶之間存在相互刺激機(jī)制[66-67]。土壤可溶性養(yǎng)分作為土壤現(xiàn)實(shí)供肥能力的指示指標(biāo)，與土壤生物活動及酶活性關(guān)系密切[65]，這也佐證了我們的研究中可溶性有機(jī)氮是調(diào)控土壤酶活性關(guān)鍵驅(qū)動因子的結(jié)果。王濤等[64]研究的退耕刺槐林土壤養(yǎng)分與酶活性關(guān)系的結(jié)果，表明土壤養(yǎng)分中全氮、總有機(jī)碳、可溶性有機(jī)氮對酶活性響應(yīng)最大，這與我們的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

長期不同施肥模式顯著影響土壤全氮和有機(jī)氮庫對外源有機(jī)物料的響應(yīng)。添加牛糞顯著增加了長期不同施肥土壤全氮、可溶性有機(jī)氮和顆粒有機(jī)氮含量，卻顯著降低了土壤微生物量氮含量；其中，

長期施有機(jī)肥與有機(jī)無機(jī)配施處理對外源牛糞的添加響應(yīng)顯著。另外，添加牛糞顯著增加了長期施有機(jī)肥處理土壤中的β-葡萄糖苷酶 (BG) 和β-纖維素酶(CBH) 活性，顯著降低了長期施有機(jī)肥及有機(jī)無機(jī)配施處理過氧化物酶 (perox) 和酚氧化酶 (phenox) 的活性。無論添加牛糞與否，不同施肥制度土壤酶活性之間差異顯著；不添加牛糞情況下，土壤酶活性的驅(qū)動因子為可溶性有機(jī)氮，添加牛糞情況下，可溶性有機(jī)氮和全氮成為其關(guān)鍵驅(qū)動因子。因此，長期施有機(jī)肥及有機(jī)無機(jī)配施可提高作物對外源有機(jī)養(yǎng)分的吸收利用，提高土壤氮庫存量，有利于氮素的長期儲存。