陳思達 卓宋明 李 娜 吳雨梅 黃 震▲ 季樂財

1.深圳市龍崗中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東深圳 518116；2.深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院保安社區(qū)健康服務(wù)中心，廣東深圳518115；3.深圳市慢性病防治中心，廣東深圳 518020

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起常見慢性傳染病，主要侵犯肺部，亦可通過血液、淋巴系統(tǒng)或創(chuàng)口直接接觸等途徑播散，可累及中樞神經(jīng)、腸道、皮膚等[1]。巨噬細胞是機體抗結(jié)核免疫的重要效應(yīng)細胞，其殺滅結(jié)核分支桿菌的途徑主要有識別吞噬、自噬、分泌NO 等炎癥因子等。同時巨噬細胞吞噬結(jié)核分支桿菌后，還可以作為抗原提呈細胞啟動獲得性免疫應(yīng)答[2]。IL-37 是近年新發(fā)現(xiàn)的抑炎性細胞因子。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結(jié)核患者血清IL-37 水平明顯升高，并且可能誘導(dǎo)體內(nèi)TH1/TH2細胞因子失衡，形成免疫抑制環(huán)境以允許結(jié)核分枝桿菌繁殖[3]。本研究通過siRNA 阻斷巨噬細胞內(nèi)源性IL-37 表達，及加入外源性IL-37 兩種干預(yù)方式，評價IL-37 對巨噬細胞吞噬殺傷結(jié)核分枝桿菌能力的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及分組

THP-1 人單核細胞系購自中國微生物菌種資源庫。分為四組，每組16 例：（1）對照組：加入非識別siRNA 作為空染對照；（2）滅活結(jié)核分支桿菌（iH37Rv）組：siRNA 空 染+iH37Rv 刺 激；（3）iH37Rv+siRNA 干擾組：siIL-37 轉(zhuǎn)染抑制IL-37 表達+iH37Rv 刺激；（4）iH37Rv+IL-37 組：加入外源性IL-37+iH37Rv 刺激。

1.2 主要材料

RPMI 1640 細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Hyclone 公司，胎牛血清購自Gibco 公司，INTERFERin體外siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Polyplus 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR 試劑盒購自toyobo 公司，PCR 引物購自Invitrogen 公司，人IL-37 ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，H37Rv 結(jié)核標準株（ATCC93009）購自北京生物制品研究所，人IL-37干擾RNA 及其對照購自美國life technologies 公司，羅丹明B 購自美國Sigma 公司，NO 檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 細胞培養(yǎng)

THP-1 細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入青- 鏈霉素，放置37℃、5%細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入PMA（終濃度為50ng/mL）誘導(dǎo)分化為巨噬細胞。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染

將裝有siRNA 干粉的EP 管短暫離心，用無血清培養(yǎng)基將siRNA 稀釋到22 mmol/L 作為siRNA 母液。取1μL上述siRNA母液，加入到191μL無血清的RPMI 160 培養(yǎng)基中，加入8μLINTERFERin試劑，室溫孵育10min，讓INTERFERin試劑和siRNA 形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，細胞轉(zhuǎn)染后孵育24h。

1.5 ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-37含量

用滅活的結(jié)核桿菌標準株H37Rv 按照細菌與細胞1 ∶10 的比例刺激THP-1 誘導(dǎo)生成的巨噬細胞，24h 之后ELISA 法檢測上清中IL-37 含量。

1.6 RT-PCR檢測細胞因子mRNA水平

使用Tizol 法提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再根據(jù)RT-PCR 試劑盒說明書操作檢測mRNA 水平。IL-37 內(nèi)參引物如下：正義鏈5’-GCTCAGGTGGGCTCCTGGAA-3’，反義鏈5’-GCTGACCTCACTGGGGCTCA-3’。

1.7 Westernblot檢測IL-37蛋白表達

吸除細胞培養(yǎng)上清，于4℃離心5min，收集沉淀細胞。RIPA 法裂解細胞，按照BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整為統(tǒng)一濃度，電泳按照80 ～90V 恒壓，分離膠110 ～120V 恒壓，到溴酚藍到達分離膠最低端并且蛋白marker 條帶清晰時停止電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1h，先后加入一抗、二抗孵育，Millipore ECL 顯色液顯影，以IL-37蛋白與β-action 蛋白條帶灰度值的比值作為相對表達量。

1.8 NO檢測

1.9 羅丹明B標記分枝桿菌標準株H37Rv

稱取0.7g 的羅丹明B 于研缽中研磨，溶于體積為100mL 的超純水中，制成羅丹明B 溶液備用。H37v 65℃滅活2h，加入羅丹明B 溶液，混勻，37℃孵育30min；10μL 菌液涂片，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察標記效率。

表1 各組巨噬細胞表達IL-37、IL-37mRNA及NO分泌量比較

表1 各組巨噬細胞表達IL-37、IL-37mRNA及NO分泌量比較

注：與iH37Rv 組比較，＊P ＜0.05

圖2 巨噬細胞吞噬功能檢測

1.10 巨噬細胞吞噬功能檢測

以羅丹明B 標記的iH37Rv 和巨噬細胞按1：10 的比例孵育2h，移去培養(yǎng)液。再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液洗去未黏附細胞，貼壁細胞即為巨噬細胞。加入0.04%中性紅生理鹽水溶液100μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)30min，棄上清，用PBS 洗3 次，加入細胞裂解液200μL/孔，靜置過夜，待細胞溶解后，使用流式細胞儀檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 iH37Rv刺激巨噬細胞分泌IL-37

使用ELISA 法檢測iH37Rv 刺激巨噬細胞后IL-37 分泌量變化，iH37Rv 組與對照組比較，IL-37分泌量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見表1。

2.2 IL-37 siRNA的有效性

iH37Rv+siIL-37 組 與iH37Rv 組 比 較，IL-37mRNA 表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見 表1。Westernblot 檢 測IL-37 蛋 白 表 達 結(jié) 果與RT-PCR 結(jié)果一致。三組灰度值比值分別為（0.174±0.052）、（0.283±0.046）、（0.102±0.022）。與iH37Rv 組比較，iH37Rv+siIL-37 組IL-37 蛋白表達量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見圖1。

圖1 Westernblot 檢測IL-37 蛋白表達

2.3 IL-37對巨噬細胞NO分泌量的影響

對 照 組、iH37Rv 組、iH37Rv+siIL-37 組 及iH37Rv+IL-37 組NO 分泌量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。其中，iH37Rv+siIL-37 組與iH37Rv 組比較，NO 分泌量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。iH37Rv+IL-37 組 與iH37Rv 組 比較，NO 分泌量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

2.4 IL-37對巨噬細胞吞噬結(jié)核桿菌能力的影響

與iH37Rv 組比較，iH37Rv+siIL-37 組巨噬細胞吞噬能力升高，iH37Rv+IL-37 組巨噬細胞吞噬能力下降（P ＜0.05），提示IL-37 可抑制巨噬細胞吞噬能力。見圖2。

3 討論

結(jié)核病是我國最為常見的傳染病之一，可侵犯肺部、骨關(guān)節(jié)、腸道等人體不同系統(tǒng)，因此被認為是一種全身感染性疾病。結(jié)核分支桿菌侵入人體后，機體主要通過形成肉芽腫的形式控制結(jié)核分支桿菌的繁殖和擴散。肉芽腫內(nèi)的巨噬細胞是控制殺滅結(jié)核分支桿菌的主要效應(yīng)細胞[4]，結(jié)核性肉腫的結(jié)局與巨噬細胞的功能類型密切相關(guān)[5]。巨噬細胞參與機體的天然免疫和獲得性免疫，是機體抵御結(jié)核桿菌侵犯的第一道防線。巨噬細胞具有強大的吞噬能力，其吞噬結(jié)核分支桿菌后，可通過自噬、凋亡等方式殺滅胞內(nèi)的結(jié)核分支桿菌，同時能夠通過產(chǎn)生誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）催化精氨酸生成NO 從而殺傷結(jié)核分支桿菌。巨噬細胞吞噬結(jié)核分支桿菌后，還可以發(fā)揮抗原提呈細胞作用，通過釋放細胞因子，調(diào)節(jié)T 淋巴細胞信號傳導(dǎo)等，啟動獲得性免疫應(yīng)答[6]。因此，巨噬細胞對結(jié)核分支桿菌的吞噬殺傷作用在機體抗結(jié)核免疫中起重要作用。

IL-37 是新發(fā)現(xiàn)的具有負性調(diào)節(jié)作用的抑炎性細胞因子。在外周血單核細胞、腫瘤細胞、胃腸道和呼吸道上皮細胞等均有廣泛表達[7]，但表達量極小。在自身免疫性疾病中IL-37 則有異常表達。比如在紅斑狼瘡、克羅恩病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫損傷性疾病中IL-37 明顯升高，推測可能為一種負反饋的抑炎作用[8]。在感染性疾病中，IL-37 高表達則區(qū)分不同情況。一方面，IL-37 升高可抑制感染性休克及病毒性肝炎的自身損害，被視為一種保護機制[9]。另一方面，在活動性肺結(jié)核中，患者血清和單個核細胞的IL-37 表達升高，則可能是結(jié)核分支桿菌誘導(dǎo)的免疫抑制，從而容許結(jié)核分支桿菌生存和繁殖[10]。本實驗使用iH37Rv 體外刺激巨噬細胞，檢測到IL-37 高表達，與既往實驗推測的結(jié)果相一致。

為了進一步評價IL-37 對巨噬細胞吞噬殺傷結(jié)核菌能力的影響，本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄siRNA 干擾IL-37 表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞對結(jié)核分支桿菌的吞噬殺傷能力增強；引入外源性IL-37 后，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞吞噬殺傷能力減弱。目前已有的研究表明，巨噬細胞的吞噬殺傷能力與其極化表型有關(guān)。經(jīng)典活化型巨噬細胞（M1）具有較強的吞噬殺傷能力，主要由Th1 型細胞信號如IFN-γ、TNF 及細菌脂多糖（LPS）等誘導(dǎo)分化而來，主要介導(dǎo)促炎反應(yīng)，抑制胞內(nèi)寄生菌生長。在M1 型占主導(dǎo)的結(jié)核肉芽腫中，結(jié)核菌顯著減少。替代活化型巨噬細胞（M2）吞噬能力弱，主要由Th2 型細胞因子如IL-13、IL-4及免疫復(fù)合物等誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要作用是介導(dǎo)抑炎反應(yīng)，促進組織修復(fù)。在M2 型占主導(dǎo)的結(jié)核肉芽腫中，常處于持續(xù)性感染狀態(tài)[11-12]。IL-37 本身為抑炎性細胞因子，目前已發(fā)現(xiàn)IL-37 能誘導(dǎo)IL-10、IL-4 等多種Th2 型抑炎性因子分泌，抑制IFN-γ、IL-12 等Th1 型促炎性因子[13]。還有研究表明IL-37 可在肝臟疾病中誘導(dǎo)巨噬細胞向替代活化型（M2）極化[14]。因此，在肺結(jié)核感染患者中，IL-37可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 的交替平衡，誘導(dǎo)巨噬細胞向M2 極化，弱化其吞噬殺傷能力[15]。

綜上所述，結(jié)核分支桿菌能夠刺激巨噬細胞分泌IL-37，IL-37 可能通過誘導(dǎo)巨噬細胞向M2 型極化進而抑制其對結(jié)核桿菌的吞噬殺傷能力。干擾IL-37 表達可增強巨噬細胞的吞噬殺傷能力。未來IL-37 可能成為結(jié)核免疫治療的有效靶點。