姚輝，張輝，陳士林，3*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中藥資源教育部工程研究中心，北京 100193；2.長春中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長春 130117；3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700

動(dòng)物藥在我國具有悠久的應(yīng)用歷史，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。歷代本草共記載動(dòng)物藥600余種，《中國中藥資源志要》收錄藥用動(dòng)物414科879屬1574種，約占全國中藥資源總種數(shù)12%，其中脊椎動(dòng)物占多數(shù)，約占藥用動(dòng)物總數(shù)的61%。動(dòng)物藥是祖國醫(yī)藥學(xué)遺產(chǎn)中的重要組成部分，具有活性成分強(qiáng)、療效確切等特點(diǎn)，如斑蝥中含有的斑蝥素為抗癌有效成分，臨床治療肝癌和膀胱癌有效，同時(shí)還具有升高白細(xì)胞的作用；水蛭含有的水蛭素是重要的抗凝血物質(zhì)，對腦血管疾病、高血脂癥等均有顯著療效[1]。大多數(shù)動(dòng)物藥材來自野生資源，部分藥材的基原動(dòng)物已被列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》和《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄，如穿山甲、麝類3種、玳瑁、黑熊、棕熊、梅花鹿、海馬屬5種等。近年來動(dòng)物藥材的需求量不斷上升，但藥用動(dòng)物的養(yǎng)殖規(guī)模遠(yuǎn)沒有達(dá)到市場需要，市場上混偽品、替代品的不斷出現(xiàn)嚴(yán)重影響了動(dòng)物藥材的應(yīng)用效果和用藥安全。動(dòng)物藥材的傳統(tǒng)鑒定方法有來源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定，在不同種類動(dòng)物藥材的鑒定中發(fā)揮著重要的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用分子生物學(xué)手段進(jìn)行動(dòng)物藥材的鑒定越來越受到關(guān)注，《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)一部收載烏梢蛇和蘄蛇的特異性PCR鑒別方法。

作為一種新興的生物鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)是應(yīng)用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA短序列進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)，自2003年由加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert提出以來[2-3]，就受到生物分類學(xué)家的廣泛關(guān)注，為因資金不足以及年輕分類學(xué)家匱乏而沉寂的生物分類學(xué)帶來了新的發(fā)展機(jī)遇[4]。陳士林等[5]首先探討了DNA條形碼技術(shù)在中藥材鑒定中應(yīng)用的技術(shù)方法、技術(shù)路線和關(guān)鍵問題，展望了DNA條形碼在中藥材鑒定中的應(yīng)用前景，并指出DNA條形碼在中藥鑒定中的成功應(yīng)用將給生藥鑒定方法帶來革命性突破。與傳統(tǒng)鑒定方法相比，DNA條形碼鑒定具有客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好和通用性等優(yōu)點(diǎn)，易于構(gòu)建統(tǒng)一的DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫[6-7]。本文對動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定體系的建立、動(dòng)物藥材DNA條形碼研究中的關(guān)鍵技術(shù)和DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行介紹，以期對動(dòng)物藥材DNA條形碼研究、珍稀藥用動(dòng)物資源保護(hù)和動(dòng)物藥材的市場監(jiān)管提供參考。

1 以COI為主體、ITS2為補(bǔ)充的動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定體系的建立

Hebert等[2]對11個(gè)門13 320個(gè)同屬物種的COI比較分析，提出COI序列可作為DNA條形碼序列對動(dòng)物進(jìn)行鑒定。在COI序列對動(dòng)物藥材的鑒定方面，張輝等[8]選取《中國藥典》中45個(gè)動(dòng)物藥材，涉及基原物種51種，分析樣品COI序列的種內(nèi)種間變異情況、barcoding gap、鑒定效率等，考察COI序列鑒定動(dòng)物藥材的有效性和準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，COI序列作為DNA條形碼適用于《中國藥典》中動(dòng)物藥材的鑒定，為COI條形碼準(zhǔn)確鑒定《中國藥典》中動(dòng)物藥材提供了分子依據(jù)。

目前，很多學(xué)者應(yīng)用COI序列對基原動(dòng)物和動(dòng)物藥材進(jìn)行了鑒定研究，其中對角甲類和蛇類動(dòng)物藥的研究報(bào)道較多。角甲類動(dòng)物藥臨床應(yīng)用歷史悠久、其作用常常是植物藥和礦物藥不能替代的，更是一些經(jīng)典名方中不可缺少的主藥之一。大多數(shù)角甲類動(dòng)物藥如鹿角、羚羊角等為骨化的動(dòng)物樣品，其DNA降解比較嚴(yán)重，提取難度較大。Luo等[9]應(yīng)用DNAout試劑盒提取角甲類樣品DNA，對15個(gè)種72份角甲類動(dòng)物藥材COI序列進(jìn)行了分析，PCR擴(kuò)增與測序效率均為100%，COI序列長度為477 bp，其中156個(gè)位點(diǎn)(32.7%)具有多態(tài)性。角甲類動(dòng)物藥種內(nèi)與種間的遺傳變異平均值分別為0.4%和15.8%，種內(nèi)的最大K2P距離均小于種間的最小K2P距離。NJ樹分析表明馬鹿、梅花鹿、麋鹿、黃麂、羚羊角、山羊角、鱉甲各自聚為一支，野生物種與家養(yǎng)物種能明顯分開。進(jìn)一步對GenBank數(shù)據(jù)庫中53個(gè)物種313條COI序列進(jìn)行了系統(tǒng)分析，BLAST1分析表明其物種鑒定成功率為100%。該研究為瀕危物種貿(mào)易監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支持，幫助限制野生動(dòng)物資源的過度利用和非法的貿(mào)易流通。Yan等[10]采用相似的方法，對角甲類動(dòng)物藥材10個(gè)物種47份樣本進(jìn)行了COI序列分析研究。張蓉等[11]和崔麗娜等[12]應(yīng)用COI條形碼序列分別對鹿茸及其混偽品進(jìn)行研究，均表明COI可鑒定鹿茸及其混偽品。劉冬等[13]對鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分別進(jìn)行DNA提取、COI序列擴(kuò)增和測定，構(gòu)建鹿類藥材8個(gè)物種101份樣品COI序列數(shù)據(jù)庫，對市售40份鹿類藥材進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中18份為《中國藥典》規(guī)定物種，22份不是《中國藥典》規(guī)定物種。劉旭朝等[14]應(yīng)用COI序列對62份市售水牛角樣品研究，發(fā)現(xiàn)34份市售水牛角藥材基原動(dòng)物為水牛，占54.8%；18份為牦牛，3份為山羊，另有2份樣品無法獲得COI序列，5份樣品無法鑒定到基原物種，已被卵菌、子囊菌、甲蟲、蛾等外源物污染。張龍霏等[15]利用COI檢驗(yàn)中藥制劑中的羚羊角藥材，表明COI基因作為DNA條形碼檢驗(yàn)中藥制劑中羚羊角方法是可行的，但因羚羊其他器官也含有相同基因，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需配合使用其他檢驗(yàn)方法。另外，COI序列也應(yīng)用于鱉甲[16]、龜甲[17-18]、穿山甲[19]及其混偽品的鑒定研究，為中藥材市場監(jiān)管提供了新的技術(shù)手段。

我國蛇類中藥應(yīng)用歷史悠久，近年來隨著蛇類野生資源逐漸匱乏，加上價(jià)格昂貴，藥材市場上出現(xiàn)偽品及混淆品的數(shù)量甚多，質(zhì)量問題嚴(yán)重，僅根據(jù)外部形態(tài)特征很難進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別。崔麗娜等[20]應(yīng)用COI條形碼序列能夠鑒定金錢白花蛇及其混偽品，廖婧等[21]收集常見藥用蛇類23種，共44個(gè)樣品，對其COI條形碼序列進(jìn)行測定，各物種種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離有顯著差異，系統(tǒng)聚類樹中樣品可聚類為與分科相一致的3個(gè)類群，各物種均形成了相對獨(dú)立的支，表明COI條形碼能夠?qū)?shí)驗(yàn)中各藥用蛇類物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。對10份市場收集的金錢白花蛇生藥樣品進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，5份為正品，其余5份為偽品，來源于赤鏈蛇Dinodonrufozonatum，與蛇類專家利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定的結(jié)果一致；且形態(tài)學(xué)上不能準(zhǔn)確鑒別的樣品，DNA條形碼技術(shù)可以迅速鑒別真?zhèn)尾⒋_定其物種信息。Cao等[22]也應(yīng)用COI序列對17個(gè)種51份蛇的樣本進(jìn)行了鑒定研究，并對10份藥材市場樣品進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其中5份為偽品。蛇蛻在采集、炮制過程中，很難保持完整的形態(tài)，商品藥材多數(shù)已經(jīng)破碎，形態(tài)鑒定特征不完整，給蛇蛻的形態(tài)鑒定帶來極大的困難。石林春等[23]應(yīng)用COI作為DNA條形碼，不僅可以鑒定中藥材蛇蛻的3種基原，而且可以區(qū)分蛇蛻及其易混偽品，表明DNA條形碼可以用于中藥材蛇蛻的鑒定。

僵蠶藥材同時(shí)包含動(dòng)物家蠶和真菌白僵菌，賈靜等[24]對市售僵蠶藥材進(jìn)行了DNA條形碼鑒定研究，采用植物基因組DNA提取試劑盒能成功擴(kuò)增白僵菌ITS序列，未能擴(kuò)增家蠶COI序列，動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒可一次性將家蠶和白僵菌的DNA同時(shí)提取出來，有效解決同時(shí)含有動(dòng)物和真菌類藥材的基原鑒定。COI序列經(jīng)鑒定為家蠶BombyxmoriL.，ITS序列經(jīng)鑒定主要來源為白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant，少數(shù)為雜菌。基于COI序列和ITS序列的DNA條形碼分子技術(shù)能穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒別動(dòng)物藥材僵蠶。

另外，應(yīng)用COI序列對麝香[25]、蜈蚣[26]、蛤殼[27]、紫河車[28]、海馬[29-30]、海龍[29]、水蛭[31]、蛤蚧[32]、桑螵蛸[33]、阿膠原材料驢皮[34]及其混偽品的鑒定研究，均表明COI序列可對正品與混偽品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，對保障臨床用藥安全和藥材市場監(jiān)控具有重要意義，整理的具體研究信息見表1。

某些動(dòng)物藥材由于DNA降解比較嚴(yán)重，標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列獲取困難。不同研究者根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列的信息設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增其中一段長度更短的DNA序列(也稱mini-barcode)，應(yīng)用mini-barcode序列進(jìn)行物種鑒定，如在蛤蚧[35]、龜甲[36]、羚羊角[37]和冬蟲夏草[38]等藥材鑒定中已有應(yīng)用。

表1 動(dòng)物藥材DNA條形碼研究信息

續(xù)表1

核ITS2序列已被證明在植物類藥材鑒定中具有很高的鑒定效率，被選作中草藥DNA條形碼鑒定的核心序列[48，50]。Yao等[48]對GenBank中12 221條動(dòng)物的ITS2序列進(jìn)行分析，ITS2序列長度分布在100～1209 bp，主要分布在195～510 bp，平均長度306 bp，GC堿基含量為48.3%，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，基于BLAST分析發(fā)現(xiàn)在物種水平上ITS2的鑒定效率為91.7%。COI序列在Cnidarians和West PalaearcticPandasyopthalmus分類群變異小，甚至沒有差異[48]，但I(xiàn)TS2序列對Cnidarians的鑒定效率為77%[2，51]。由于COI等線粒體基因是母系遺傳，在動(dòng)物的鑒定中應(yīng)納入核基因等其他相關(guān)信息。因此，Yao等[48]提出ITS2可作為COI序列的補(bǔ)充序列對動(dòng)物進(jìn)行鑒定。Xiang等[49]應(yīng)用ITS序列可快速準(zhǔn)確鑒定冬蟲夏草及12種常見混偽品及近緣物種。陳士林等[52]在大量樣本研究的基礎(chǔ)上，建立了以COI為主體、ITS2序列為補(bǔ)充的動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定體系，該體系已納入《中國藥典》[53]。

2 動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定關(guān)鍵技術(shù)

動(dòng)物藥材來源復(fù)雜，有來自動(dòng)物的干燥全體(如水蛭、全蝎、蜈蚣、斑蝥、土鱉蟲、九香蟲等)，有除去內(nèi)臟的動(dòng)物體(如地龍、蛤蚧、烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇等)，有動(dòng)物體的某一部分(如鹿茸、鹿角、水牛角、鱉甲、龜甲、雞內(nèi)金、哈蟆油等)[1]，DNA存在不同程度的降解，甚至嚴(yán)重的降解，DNA條形碼序列能否順利獲得是對動(dòng)物藥材進(jìn)行鑒定的前提條件。

2.1 樣品前處理

動(dòng)物藥材樣本因儲(chǔ)存環(huán)境差異，為避免被其他污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一般先用75%乙醇擦拭表面進(jìn)行消毒或清洗，如鹿類藥材[13]、水牛角[14]、穿山甲[19]、僵蠶[24]、蜈蚣[26]、紫河車[28]、海馬[30]、蛤蚧[32]等。嚴(yán)華等[34]對阿膠原材料驢皮及其混偽品鑒定時(shí)，采用70%乙醇浸泡達(dá)到清潔藥材表面的目的。乙醇擦拭的樣品應(yīng)放超凈工作臺(tái)上揮干乙醇，部分樣品取樣時(shí)還需通過紫外照射進(jìn)行消毒，如穿山甲[19]、蟾皮[44]等。

基原動(dòng)物樣本如保存于95%乙醇中，如蛇類或其他動(dòng)物標(biāo)本取樣時(shí)取其肌肉組織，置于蒸餾水中或流水浸泡過夜，以除去乙醇[20-21]。因藥材樣本的表面DNA易降解或被真菌及寄生蟲等污染，取樣時(shí)需去除外部組織，取藥材內(nèi)部組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或盡量取其肌肉組織；動(dòng)物肢體部分因內(nèi)臟以及食物殘留，取樣時(shí)應(yīng)避開這些部位。如海馬樣品用止血鉗撕下海馬尾部表皮后，割取剝?nèi)ケ砥さ奈膊克幉牟⒓羲閇30]；蛤蚧樣品應(yīng)多取肌肉組織部分，樣品的外皮部分與骨骼部分，質(zhì)地堅(jiān)硬，不易粉碎，從其中提取基因組DNA比較困難[32]；穿山甲等可取其甲片殘留的腹面皮膚組織[19]。取樣的前處理及取樣部位，直接決定DNA提取的難度和效果，可參考與實(shí)驗(yàn)樣品最接近的動(dòng)物藥材的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行操作。

2.2 DNA提取

DNA提取包括破碎細(xì)胞、釋放核酸、DNA的分離與純化、DNA濃縮、沉淀與洗滌等基本步驟。動(dòng)物藥材DNA提取方法目前主要應(yīng)用試劑盒法、Chelex-100法、磁珠法等[54]。部分動(dòng)物藥材因DNA降解可增大取樣量，如水牛角取樣60 mg[14]、角甲類藥材研究取樣達(dá)200 mg[9-10]，而哈蟆油藥材溫水中浸泡體積可膨脹10～15倍，取樣時(shí)則應(yīng)進(jìn)行減量，如5 mg即可獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的DNA[55]。動(dòng)物藥材粉碎前應(yīng)剪碎或切小，利于充分粉碎。嚴(yán)華等[34]鑒定阿膠原材料驢皮時(shí)，其樣品為凍干品，質(zhì)地硬而韌，難以用球磨機(jī)直接粉碎，在粉碎時(shí)即加入試劑盒中的GA緩沖液，水浴裂解后加入三氯甲烷，除去蛋白質(zhì)。延長水浴時(shí)間對于提高提取效率是一個(gè)很有效的方法，如56 ℃水浴2～8 h或過夜，在羚羊角、蜈蚣、紫河車和蛤蚧等藥材中都獲得很好的提取效果[15，26，28，32]。對于蛋白質(zhì)含量高的材料，需要加大試劑用量[28]，或用三氯甲烷-異戊醇多次抽提[30，32]，對于脂類含量多的樣品，如哈蟆油，加入酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)可有效去除脂肪[55]。對DNA降解嚴(yán)重的動(dòng)物藥材，如角甲類，還可采用該類藥材專用的DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，也可獲得不錯(cuò)的提取效果[9-10，14]。

劉旭朝等[56]基于SDS法DNA提取原理，對動(dòng)物藥材DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化研究。通過對動(dòng)物干燥全體、角類、骨甲類、組織類、其他類(卵鞘等)等不同用藥部位的市售動(dòng)物藥材26種121份樣品篩選最佳裂解液配方，結(jié)果表明裂解液配方為1% SDS、0.03 mol·L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L-1NaCl時(shí)，對不同用藥部位動(dòng)物藥材DNA提取效果最佳，并可實(shí)現(xiàn)對蟬蛻等提取困難樣本DNA的提取，利用優(yōu)化裂解液提取的121份市售動(dòng)物藥材DNA滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。該裂解液配方可用于除殼類、分泌物類、加工品外的不同用藥部位動(dòng)物藥材DNA提取，為動(dòng)物藥材分子鑒定提供了技術(shù)支持。楊璐等[57]使用常規(guī)定性濾紙作為核酸吸附的載體，通過裂解液的裂解，釋放核酸并吸附在濾紙上，利用洗脫液進(jìn)行核酸純化，可使整個(gè)核酸提取過程在30 s內(nèi)完成，吸附核酸的濾紙可直接放入反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，提取得到的核酸經(jīng)擴(kuò)增驗(yàn)證，可獲得與傳統(tǒng)提取方法相一致的檢測結(jié)果。此方法簡單易行、速度快、成本低，可以成功提取不同藥用部位的中藥材核酸，可使核酸提取變得越來越大眾化，不再局限于專業(yè)人員和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

2.3 PCR擴(kuò)增與測序

COI序列作為動(dòng)物的核心DNA條形碼，使用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198對大多數(shù)動(dòng)物類群擴(kuò)增可獲得其COI序列，對于昆蟲綱、兩棲綱等類群，還可使用文獻(xiàn)報(bào)道的適用于該類群的擴(kuò)增引物，具體的引物序列及相關(guān)文獻(xiàn)見表2。如以上引物還不適用，可應(yīng)用相關(guān)引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫中相近物種的COI序列或線粒體全基因組序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。對于DNA降解嚴(yán)重的動(dòng)物藥材，還可設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增更短的COI片段進(jìn)行分析研究[9-10]。作為COI的補(bǔ)充序列，核ITS2序列擴(kuò)增引物見表2。

表2 動(dòng)物DNA條形碼通用引物序列

PCR擴(kuò)增體系以25 μL為參照，包括2×PCR Mixture 12.5 μL，10 μmol·L-1正反向引物，模板DNA(約30 ng·μL-1)1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL，同時(shí)設(shè)置未加模板DNA(ddH2O代替)的陰性對照。實(shí)際應(yīng)用中，PCR擴(kuò)增體系和程序可根據(jù)具體情況予以調(diào)整。目前，在動(dòng)物藥材的擴(kuò)增引物方面，通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198不適用于海馬、阿膠基原動(dòng)物驢皮、哈蟆油、九香蟲及蘄蛇COI序列的擴(kuò)增，相關(guān)研究人員已設(shè)計(jì)專屬的引物并獲得其COI序列[30，34，54，58]。水蛭應(yīng)用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198和LepF1/LepR1均可[58]。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用1.2%～2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，應(yīng)用通用引物擴(kuò)增COI序列的樣品應(yīng)在約700 bp處有一條單一明亮的條帶，陰性對照應(yīng)無條帶。對有擴(kuò)增條帶的PCR產(chǎn)物，在紫外燈下迅速切取目的條帶所在位置的凝膠，應(yīng)用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，應(yīng)用Sanger測序法進(jìn)行雙向測序，測序引物同PCR擴(kuò)增引物。

2.4 序列質(zhì)量評價(jià)與分析

雙向測序峰圖在進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)[50]后進(jìn)行序列拼接，獲得相應(yīng)的DNA條形碼序列。獲得的DNA條形碼序列首先進(jìn)行校對，可采用BLAST分析防錯(cuò)、系統(tǒng)樹分析防錯(cuò)和barcoding gap檢驗(yàn)防錯(cuò)[64]，保證DNA條形碼序列的正確。正確的DNA條形碼序列，應(yīng)用CLUSTAL X、CLUSTAL W[65]或MUSCLE等[66]軟件進(jìn)行多序列比對，應(yīng)用MEGA等[67]軟件進(jìn)行種內(nèi)、種間遺傳距離和系統(tǒng)聚類樹分析。

3 動(dòng)物DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫

目前應(yīng)用的動(dòng)物DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫主要有GenBank(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)、BOLD(Barcode of Life Database)[68]、中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)[69]和MMDBD(Medicinal Materials DNA Barcode Database)[70-71]等。GenBank為公共數(shù)據(jù)庫，全世界研究者的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都可以上傳至GenBank，數(shù)據(jù)量龐大，但因主要是儲(chǔ)存功能，所以對序列的真實(shí)性不做判斷，因而存在一定的錯(cuò)誤率，影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。BOLD(http：//www.boldsystems.org)是由國際生命條形碼協(xié)會(huì)(The Consortium of Barcode of Life，CBOL)建立的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，動(dòng)物COI序列豐富，目前物種水平的DNA條形碼序列包括195 887個(gè)物種的3 267 402條COI序列。MMDBD數(shù)據(jù)庫(https：//rdccm.cuhk.edu.hk/mherbsdb/)由香港中文大學(xué)邵鵬柱教授團(tuán)隊(duì)建立，在2010年建立的MMDBD V1.0版本[70]基礎(chǔ)上提高到V1.5版本[71]，目前包括2111個(gè)藥用物種的62 011條序列。

中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所和中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所共同建立[69，72]，目前包含百萬余條DNA條形碼序列，涵蓋中國、日本、韓國、印度、歐盟和美國藥典幾乎所有草藥物種，可進(jìn)行中藥材(動(dòng)物類、植物類和真菌類)DNA條形碼鑒定。賈靜等[47]基于中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對市售鹿茸粉的基原物種進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，其中有38%為《中國藥典》規(guī)定的正品來源，而62%為其他基原，以馴鹿RangifertarandusL.為主，有些待檢樣品包裝明確標(biāo)示為梅花鹿鹿茸粉，其鑒定結(jié)果為馬鹿或馴鹿。應(yīng)用該系統(tǒng)對市售僵蠶的鑒定研究發(fā)現(xiàn)，除白僵菌外，少數(shù)為雜菌，且為致病菌株[24]。

4 結(jié)語

Miller等[73]認(rèn)為DNA條形碼技術(shù)正在推動(dòng)分類學(xué)的“文藝復(fù)興”，能夠緩解傳統(tǒng)鑒定人才缺乏的現(xiàn)狀，完成一些傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和保護(hù)生物學(xué)無法完成的工作，且技術(shù)方法易于掌握，不需要多年的經(jīng)驗(yàn)積累。動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定工作已經(jīng)有了大量的研究報(bào)道，進(jìn)一步完善動(dòng)物藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫是今后一個(gè)時(shí)期的主要任務(wù)，并在國家相關(guān)主管部門的組織下，盡快開展動(dòng)物藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列研究工作。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用下一代測序技術(shù)開展動(dòng)物藥線粒體基因組測定的技術(shù)已經(jīng)成熟[74]，對于難鑒定的近緣物種可應(yīng)用線粒體基因組作為“超級條形碼”進(jìn)行區(qū)分。另外對中藥制劑中動(dòng)物藥材基原物種的鑒定和動(dòng)物全基因組序列測定研究會(huì)越來越多[75-76]，將進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)物藥材鑒定研究及其本草基因組學(xué)[77]的發(fā)展。