司振書 殷國政 路建彪

摘要：為H9N2亞型AIV進行快速、準確鑒定與診斷，根據(jù)H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因各設(shè)計1對引物，建立了一種對2個表面基因同時進行擴增的雙重RT-PCR檢測方法。HA、NA基因預(yù)期擴增的目的片段長度分別為700、423 bp。通過對H9N2亞型禽流感病毒不同稀釋度的尿囊液進行檢測，證實病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL。采用該方法對H1～H15和N1～N9等亞型流感病毒及新城疫病毒等進行檢測，結(jié)果只有H9N2亞型AIV出現(xiàn)2個特異性目的條帶，與其他常見禽病病原無交叉反應(yīng);用建立的雙重RT-PCR和病毒分離2種方法同時對送檢樣品進行檢測，結(jié)果2種方法的符合率達99.77%，說明該檢測方法特異性強、敏感性較高，在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒;H9N2亞型;雙重RT-PCR;檢測方法

中圖分類號： S852.65+7 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0035-03

H9N2亞型禽流感病毒為中低致病力毒株，分布廣泛，司振書等對山東省雞群進行了H9亞型AIV的感染情況進行了調(diào)查，疑似流感病雞病料RT-PCR陽性率為8.41%[1]。該病毒能造成雞群的免疫抑制，如果與其他病原協(xié)同感染則可引起禽類嚴重發(fā)病，如與金黃色葡萄球菌混合感染可引起肉雞發(fā)病，死亡率達6%[2]。2013年，我國發(fā)生了H7N9感染人事件，6個內(nèi)部基因全部來自于H9N2 AIV[3-4]，1999年來發(fā)生了多次H9N2亞型AIV感染人的事件[5]，給人類健康帶來威脅。禽流感病毒有多種檢測方法，包括血凝（HA）、血凝抑制（HI）試驗，神經(jīng)氨酸酶抑制（NI）試驗，瓊脂擴散試驗（AGP），酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），病毒的中和試驗（NT），免疫熒光抗體技術(shù)（IFA）和real-time RT-PCR等。司振書等建立了針對H9亞型AIV的RT-PCR檢測方法[6]，包紅梅等建立了一步法RT-PCR檢測方法，具有較好地特異性和敏感性[7]，但以上方法沒有對NA基因進行擴增，不能確定NA亞型。司振書等對H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因分別進行擴增，操作較麻煩且多耗試驗材料[8]。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法則需要多種亞型的血清和抗原，費時費力。根據(jù)H9N2亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因各設(shè)計1對引物，初步建立了一種針對H9N2亞型AIV的雙重RT-PCR檢測方法，該方法特異性強、敏感性較高。該試驗于2012年在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物流感研究室完成。

1 材料與方法

1.1 毒株

H9N2亞型AIV標準參考毒株、H1～H15亞型AIV、N1-N9 亞型AIV、雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、馬立克氏病病毒及雞痘病毒等毒株，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物流感研究室保存并提供。

1.2 引物的設(shè)計、合成與篩選

針對HA、NA基因的保守區(qū)序列分別設(shè)計特異性引物，用Oligo 4.0軟件分析上下游引物是否匹配，將分析合格的引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司北京合成部合成。分別合成了針對HA、NA基因的5對引物，用H9N2亞型AIV進行篩選，根據(jù)擴增效率確定的引物對見表1。HA、NA基因擴增的目的片段長度分別為700、423 bp。

1.3 主要試劑

TRIzol Reagent，由Invitrogen公司生產(chǎn);反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622，F(xiàn)ermentas;三氯甲烷、異丙醇、乙醇等均為市售;T4連接酶，由Promega公司生產(chǎn);GoldenView、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，由北京索萊寶公司生產(chǎn);Trans5K DNA Marker、DL2000DNA Marker、DH5α感受態(tài)細胞，由北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);PMD-18T載體，由TaKaRa公司生產(chǎn)。

1.4 H9N2亞型AIV病毒含量的測定

取感染H9N2亞型禽流感病毒A/雞/山東/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種3枚雞胚，0.1 mL/枚。35 ℃孵育48 h，將雞胚于4 ℃過夜，收獲尿囊液，測定其血凝效價，按Reed-Muench法公式計算半數(shù)感染量。

1.5 病毒RNA的提取

Trizol法提取毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的RNA，立即作RT-PCR的擴增或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 cDNA的合成

按試劑盒說明書進行。

1.7 雙重RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

對雙重RT-PCR的反應(yīng)體系和變性、退火、延伸溫度和時間、循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)條件進行優(yōu)化。最后確定采用總體積為25 μL的反應(yīng)體系：2×PCR mix buffer12.5 μL;濃度為 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1.0 μL;HA下游引物H9-R 1.0 μL;濃度為20 pmol/μL NA上游引物N2-F 1.5 μL;NA下游引物N2-R 1.5 μL;ddH2O補足至25.0 μL。最后確定雙重RT-PCR最佳循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，48 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，34個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.8 雙重RT-PCR特異性試驗

用建立的雙重RT-PCR方法分別對H1～H15亞型AIV、N1-N9亞型AIV進行檢測，以檢測其他亞型病毒是否存在假陽性，即是否與其他亞型AIV具有交叉反應(yīng);用該方法對雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、馬立克氏病病毒及雞痘病毒等毒株進行檢測，分析該雙重RT-PCR檢測方法的特異性。

1.9 雙重RT-PCR敏感性試驗

對已確定病毒含量的毒株A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液進行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀釋度稀釋，對不同稀釋度尿囊液進行檢測以確定其敏感性。

1.10 雙重RT-PCR的應(yīng)用

對送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品用雙重RT-PCR和病毒分離2種方法檢測，以檢測2種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒含量的測定結(jié)果

經(jīng)測定H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液，病毒含量為1×107.25 EID50/100 μL。

2.2 H9、N2雙重RT-PCR擴增結(jié)果

H9N2亞型AIV A/Chicken/Shandong/ZB/2007和A/Chicken/Shandong/6/96的雙重RT-PCR擴增結(jié)果見圖1，均獲得700、423 bp的目的片段。

2.3 特異性試驗結(jié)果

對H1～H15亞型AIV（其中H9 AIV為H9N2亞型）進行雙重RT-PCR檢測，H9N2亞型AIV擴增出700、423 bp的2個目的條帶，其他亞型病毒均沒有擴增出目的條帶（圖2）。對N1～N9等其他亞型（其中N2 AIV為H9N2亞型）AIV進行檢測，H9N2亞型AIV擴增出700、423 bp的目的條帶，其他亞型病毒均未出現(xiàn)條帶（圖3）。對NDV、IBV等其他病毒進行檢測（圖4）。H9N2亞型AIV擴增出700、423 bp的2個目的條帶，而NDV、IBV等均無條帶產(chǎn)生。結(jié)果表明，所建立的雙重RT-PCR檢測方法具有很強的特異性，可以特異性地檢出H9N2亞型禽流感病毒。

2.4 敏感性試驗結(jié)果

對不同稀釋度的病毒液分別進行檢測（圖5）。在10-3稀釋時，仍然可以擴增出2個明顯的目的條帶，說明該方法對病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL，靈敏度較高、敏感性較強。

2.5 雙重RT-PCR的應(yīng)用

用建立的雙重RT-PCR和病毒分離與血清學(xué)鑒定2種方法，同時對送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品進行檢測，結(jié)果2種檢測方法的符合率達 99.77%（表1）。

3 討論

H9N2亞型AIV在我國雞群中分布廣泛，并能引起人類感染，給養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生造成重大影響，因此對其快速準確地鑒定非常重要。RT-PCR診斷技術(shù)可從基因水平檢測AIV，具有較高的特異性和敏感性。建立的雙重RT-PCR檢測方法對H1～H15、N1～N9等亞型流感病毒，新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等進行檢測，只有H9N2亞型AIV出現(xiàn)2個特異性目的條帶，其他亞型AIV與NDV等無任何條帶，說明該方法對其他亞型AIV及NDV等無交叉反應(yīng)，具有特異性;通過對不同稀釋度的H9N2亞型AIV進行檢測，證實病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25 EID50/100 μL，說明該檢測方法敏感性較高;對送檢的226份具呼吸道癥狀的病雞病料和201份棉拭子樣品進行檢測，其結(jié)果與經(jīng)典的病毒分離與血清學(xué)鑒定符合率達99.77%。

該方法H9、N2基因擴增所產(chǎn)生的目的條帶分別為700、423 bp，相比而言，700 bp的條帶更亮，而長度為423 bp的條帶較暗，盡管對各引物濃度、模板用量、退火溫度等因素進行了多次試驗，反復(fù)優(yōu)化，擴增片段仍然一明一暗，短的片段雖相比暗些，但條帶明顯，不影響結(jié)果的判斷。建立的雙重 RT-PCR 方法可對H9N2亞型AIV進行快速鑒定，該方法的建立為進一步進行試劑盒的研制打下了良好的基礎(chǔ)，在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有較好的應(yīng)用前景。

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