么大軒 張彬 劉松濤

摘要：利用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）與簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）2種分子標記對23份甜玉米自交系進行遺傳多樣性評價。結(jié)果表明，6對針對su1基因的SNP引物分別在 7 790、8 210、10 550 bp位點處檢測到22、17、23個自交系發(fā)生突變。23份甜玉米自交系在相似系數(shù)為0.55處被劃分為4個SNP類群;用19對針對玉米10條染色體的SSR引物共檢測出83個多態(tài)性位點，平均每對引物檢測到的多態(tài)性位點數(shù)為4.4個，在相似系數(shù)為0.55處被劃分為5個SSP類群。2種分子標記在類群劃分中既存在一定的相關(guān)性，也存在一定的差異。用SNP、SSR法檢測的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.64、0.71，表明23份甜玉米自交系存在比較豐富的遺傳變異，種質(zhì)資源較為豐富。

關(guān)鍵詞：甜玉米;分子標記;SNP;SSR;聚類分析

中圖分類號： S513.032 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0045-05

甜玉米是玉米屬的一個亞種，起源于美洲大陸，是一種集糧、果、蔬、飼于一體的經(jīng)濟型作物，人類種植和食用甜玉米已有100多年的歷史[1]。甜玉米鮮穗可直接上市或加工，乳熟時籽粒中富含蛋白質(zhì)、水溶性多糖、多種游離氨基酸和維生素，具有較高的營養(yǎng)價值、加工價值和經(jīng)濟價值。隨著人們生活水平的提高，甜玉米也迎來了更多的消費者[2]。美國是世界上開展甜玉米育種研究最早的國家，早在1828年，美國人索布就發(fā)表了關(guān)于甜玉米研究的第1篇論文，1836年諾埃斯·達林培育出了第1個甜玉米品種達林早熟[3]。而我國對甜玉米的研究起步較晚，直到1968年，才由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)培育出了首個甜玉米品種北京白砂糖[4]，到了20世紀80年代，又有一批新品種出現(xiàn)，如農(nóng)梅Ⅰ號、東甜2號、金甜1號、甜玉2號等，但是其應(yīng)用和推廣面積有限[5-6]。

從20世紀90年代至今，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展、人民生活水平的提高以及甜玉米加工產(chǎn)品的出現(xiàn)，對甜玉米的需求量與種質(zhì)資源遺傳多樣性的需求不斷提高[7]。但是，由于我國不是甜玉米的起源中心，很多材料依賴于從美國、泰國等海外引進，甜玉米的親緣關(guān)系比較近，類型較單一[8]，從而嚴重影響了我國甜玉米育種的進一步發(fā)展。因此，對甜玉米的遺傳多樣性進行研究尤其重要。

近幾年來，分子標記技術(shù)發(fā)展迅速，作為新的手段和方法已被用于檢測玉米的遺傳多樣性，主要包括限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）等分子標記技術(shù)。其中單個堿基變異的SNP作為第3代分子標記，具有密度高、分布廣等優(yōu)勢，在水稻、玉米等植物性狀標記分析、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等方面有廣闊的應(yīng)用前景[9-12]。在玉米上，康奈爾Buckle實驗室和Illumina公司構(gòu)建了高密度的SNP標記遺傳連鎖圖譜，為分子育種提供了可靠的信息。SSR是一類由 1～6個堿基組成的基因串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，它們廣泛分布于基因組的不同位置[13]。SSR具有多態(tài)性水平高、遺傳方式簡單、結(jié)果重現(xiàn)性好、穩(wěn)定可靠、需要的DNA量少且操作簡單等特點[14]，被育種研究者們廣泛使用[15-16]。然而，目前利用分子標記對甜玉米進行遺傳多樣性研究的報道還較少。

為了綜合SNP分子標記與SSR分子標記的優(yōu)點，增強試驗的準確性及穩(wěn)定性，同時探究2種分子標記的聯(lián)系與差異，本研究采用SNP、SSR 2種分子標記同時對23份甜玉米材料進行遺傳多樣性研究，以期為甜玉米育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的23份甜玉米自交系（均為su1甜玉米）和1份常規(guī)對照自交系由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究室提供，其名稱詳見表1。

SNP檢測試驗所用引物參照韓國Shin等研究設(shè)計的6對SNP引物[17]，詳見表2。SSR檢測試驗所用引物參照CIMMYT（國際玉米小麥改良中心）公布的針對玉米10條染色體的核心引物，從中篩選出19對帶型清晰、穩(wěn)定性好的引物進行SSR分析，相應(yīng)的引物序列見表3。以上引物均由北京天一輝遠生物科技有限責任公司合成。

1.2 試驗方法

本試驗于2015年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)種子科學(xué)與技術(shù)實驗室進行，甜玉米材料種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三分廠試驗田。取0.5 g甜玉米鮮葉片，用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法對供試的23份甜玉米進行DNA提取，并用NanoDrop ND1000型紫外分光光度計測定DNA分子D260 nm/D280 nm及濃度，之后統(tǒng)一將濃度稀釋至100 ng/μL，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)體系和條件

20 μL PCR反應(yīng)體系：2 μL 10×Taq 緩沖液（含Mg2+）、1.6 μL dNTP（2.5 mmol/L）、1 μL前引物、1 μL后引物、0.2 μL Taq酶（2.5 U/L）、1 μL DNA模板（100 ng/μL）、13.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 變性 30 s，X ℃退火[X=（前引物Tm+后引物Tm）/2-1，Tm為理論退火溫度]45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物的檢測

1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳 在每個PCR體系中加入5 μL加樣緩沖液6×loading buffer，取10 μL上樣于1.5%瓊脂糖凝膠上，于180 V、300 mA、80 W電泳15 min，用EB（溴化乙錠）顯色，用BioRAD凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，記錄條帶信息。

1.4.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 在每個PCR體系中加入5 μL加樣緩沖液6×loading buffer，取2 μL上樣于6%聚丙烯酰胺凝膠上，于300 V、200 mA、100 W電泳45 min，用銀染法顯影，將膠置于燈箱上觀察拍照，記錄條帶信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析方法

根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果讀取條帶，同一長度處有帶的記為1，無帶的記為0，缺失的記為9，用NTSYS Version 2.10e軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果分析

用6對針對su1基因設(shè)計的SNP引物進行PCR擴增，其中在1～23號供試甜玉米中均能檢測到點突變，而對照常規(guī)玉米自交系Mo17在所檢測的3個變異位點上均無擴增條帶，即在檢測的3個位點上均無變異，8210（A/G）位點的檢測結(jié)果見圖1。

由表4可以看出，在7790位點處，有22個自交系發(fā)生突變，116327、116329、116353等15個自交系發(fā)生C堿基突變，116359-60、 116377、116432等7個自交系發(fā)生T堿基突變。

在829位點處，有17個自交系發(fā)生突變，116327、116377-78、116390等8個自交系發(fā)生A堿基突變，116432、116471、116484等9個自交系發(fā)生G堿基突變。在10550位點處，23個自交系全部發(fā)生突變，116432、116455、116471等5個自交系發(fā)生G堿基突變，116469、116379、116385等18個自交系發(fā)生A堿基突變。

通過對10條染色體的核心引物進行篩選，獲得19個條帶清晰、多態(tài)性強的SSR引物。利用篩選出的引物對供試的23份甜玉米材料進行DNA擴增，其中引物bnlg439的擴增條帶如圖2所示。對全部擴增結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，擴增出的條帶數(shù)在4～11條之間，19對SSR引物共擴增出114條條帶，其中多態(tài)性條帶83條，平均每對引物檢測到的多態(tài)性位點為4.4個，多態(tài)性條帶數(shù)占總條帶數(shù)的73%。

2.2 遺傳相似性分析

根據(jù)2種分子標記結(jié)果，計算23份甜玉米的遺傳相似系數(shù)，其中SNP相似系數(shù)為0.28～1.00，平均遺傳相似系數(shù)為0.64;SSR遺傳相似系數(shù)為0.47～0.95，平均遺傳相似系數(shù)為0.71。由此可見，2種標記方法的平均遺傳相似系數(shù)基本一致，說明含有su1基因的甜玉米突變體的遺傳背景存在比較豐富的遺傳變異。

2.3 聚類分析

當相似系數(shù)為0.55時，23份甜玉米材料被劃分為4個SNP類群（SNP groups，簡稱SNPGs），分別為SNPGⅠ、SNPGⅡ、SNPGⅢ和SNPGⅣ（圖3）。由表4可以看出，SNPG Ⅰ包含116327、116390、紫su5-3、紫su5-12、紫su5-3-3、116377-78、116385、黃su7-8、116375、116329、116353、116379、116394、116424共14份材料，占60.9%;SNPG Ⅱ僅含有1份材料，即116455，占4.3%;SNPG Ⅲ、SNPG Ⅳ各含有4份材料，分別為116359-60、116377、紅su5、116469和116432、116471、116485、116484，各占供試材料的17.4%。

由圖4的SSR標記聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當相似系數(shù)為0.55時，23份甜玉米自交系被分為5個類群（SSR groups，簡稱SSRGs）。其中SSRGⅠ包括紫su5-3、紫su5-12、黃su7-8、116390、116329、116375、紫su5-3-3等13份材料;SSRGⅡ和SSRGⅣ分別包含116359-60、116394、116424和 116377-78、116469、116471;SSRGⅢ和SSRGⅤ分別包含116484、116485和116432、116455（表5）。

3 討論

玉米胚乳基因組內(nèi)某一特定核苷酸位置發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛倒、插入、缺失等都有可能使其突變?yōu)樘鹩衩?。su突變體編碼的蛋白質(zhì)，即異淀粉酶是淀粉去分支酶的一種[18-19]，能使糖向淀粉的轉(zhuǎn)化過程受阻，造成中間產(chǎn)物大量積累，因而發(fā)生相應(yīng)突變的玉米中的蔗糖、還原糖含量顯著高于普通玉米，使玉米未成熟籽粒中大量積累水溶性多糖[20-21]。

本試驗應(yīng)用SNP、SSR 2種分子標記研究su1型甜玉米。su1基因位于第4染色體的第8～66位點，在該位點先后發(fā)現(xiàn)了sul-am、sul-B n2、sul-cr、sul-st和sul-R等等位基因[1]。本試驗選用等位基因特異性PCR對su1基因的7790、8210及10550這3個SNP位點進行分型，該方法具有成本低、易操作等優(yōu)點，但仍需要對引物退火溫度以及反應(yīng)條件進行一定的摸索。有報道指出，等位基因特異PCR反應(yīng)體系具有很高的靈敏性[22]，然而試驗中依然會有隱約的非特異性條帶出現(xiàn)，本試驗中檢測的甜玉米在7790、8210、10550這3個突變位點中至少存在1～2個突變，PCR反應(yīng)對退火和延伸過程的時間和溫度比較敏感[17]，因而不適宜的反應(yīng)條件可能會導(dǎo)致堿基錯配，使得堿基發(fā)生非特異性結(jié)合。本試驗通過適當提高退火溫度，較大程度地抑制了非特異性條帶的產(chǎn)生，與樂素菊等的研究結(jié)果[23]一致。SSR分子標記技術(shù)具有操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點，是近10年來常用的研究遺傳多樣性的方法[24]。趙波等利用SSR標記，對小豆種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析，檢測到86個等位變異[25]。陳婧等曾利用SSR分子標記技術(shù)對玉米進行了遺傳多樣性分析[26-28]。胡萍等利用SSR分子標記技術(shù)對貴州的108份玉米品種進行了遺傳多樣性分析，得出其遺傳相似系數(shù)在0.44～0.99之間[29]。王利峰等利用表型和SSR分析了河南省玉米的遺傳多樣性，得出其遺傳相似系數(shù)為0.63～0.89[30]。而本試驗利用19對SSR引物對23份甜玉米自交系進行遺傳多樣性分析，共檢測出80個等位基因有變異位點，檢測到的等位基因數(shù)為4.4個，遺傳相似度系數(shù)為0.47～0.95，表明甜玉米種質(zhì)來源較廣泛，遺傳基礎(chǔ)豐富。本研究將供試材料劃分為5大類，從分子水平分析了甜玉米的群體遺傳結(jié)構(gòu)和多態(tài)性水平，為研究親本選配、新種質(zhì)創(chuàng)制等提供了依據(jù)。

本試驗利用SNP、SSR 2種分子標記，研究了甜玉米的遺傳多樣性，在甜玉米親緣劃分上，2種分子標記存在一定的相關(guān)性，均能將紫su5-3、紫su5-12和紫su5-3-3等姊妹系聚在一起，同時也存在一定的差異，如SSR標記比SNP標記劃分的類群多1個。本研究結(jié)果也驗證了用分子標記探究種質(zhì)資源血緣關(guān)系的科學(xué)性、準確性，由于引物數(shù)量及試驗材料數(shù)量的限制，要得到更精確的群體結(jié)構(gòu)劃分還需要進一步研究。

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