閆楊 劉月靜 王帥珂

摘要：采用溫室盆栽試驗的方法，研究3株對黃瓜枯萎病具有較強抑制作用的芽孢桿菌（Bacillus subtilis） B579、Bacillus subtilis 2-1、Bacillus amyloliquefaciens 9-2對黃瓜根際土壤關鍵酶活性的影響。結果表明，生防菌的施入能明顯提高黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶、過氧化氫酶、幾丁質酶和脲酶等4種與土壤肥力相關酶的活性。其中，生防菌處理的酶活性最高，其次為拮抗處理和空白對照處理，病原菌處理的酶活性最低。因此，生防菌處理不僅對黃瓜具有防病促生長的作用，同時還能提高土壤關鍵酶活性，增加土壤肥力，為今后生態(tài)環(huán)保型生防菌劑的開發(fā)和利用奠定了理論基礎。

關鍵詞：生防芽孢桿菌;土壤酶活性;黃瓜枯萎病;土壤肥力

中圖分類號： S476+.9 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0108-03

黃瓜枯萎病是一種嚴重危害黃瓜的土傳性真菌病害[1]，其病原為鐮孢菌屬的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），病菌主要侵入幼根或傷口，使瓜葉迅速萎蔫。一般苗圃黃瓜的枯萎病發(fā)病率為20%～50%，嚴重的可達80%以上。土壤是農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的樞紐[2]，負責物質與能量交換，而土壤酶作為土壤中具有高度催化作用的蛋白質，主導著土壤中與物質和能量轉化有關的生物化學過程[3]。土壤酶的生物活性指標一直是土壤酶學研究的重點，并逐漸成為土壤微生物生態(tài)效應研究的重要方向和領域[4-7]。土壤酶活性的高低可較有效地反映土壤中各種生化反應的強度和方向，代表著土壤中物質代謝的旺盛程度，是土壤肥力的重要指標[8]。脲酶是土壤中最活躍的水解酶類，是廣泛存在于細菌、真菌和高等植物中的酰胺酶，與土壤的微生物數量、有機質含量等密切相關，能水解土壤中的尿素，釋放出供作物利用的銨，其活性與土壤肥力水平顯著相關[9]。土壤過氧化氫酶活性與土壤的呼吸強度及土壤微生物活動相關，是重要的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子，可以表現出土壤氧化還原的能力[10]，能有效防止過氧化氫的毒害[11]。堿性磷酸酶屬于水解酶類，土壤中的有機磷在土壤磷酸酶的酶促作用下才能轉化為可利用的形態(tài)[12]。幾丁質酶參與土壤有機碳和氮的轉化，可以將幾丁質轉化為氨基糖，是土壤中礦質氮的主要來源[13-14]。

芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧的革蘭氏陽性菌[15]，對植物生長具有促進作用，可以將物質轉化為營養(yǎng)成分供給植物或者刺激土壤中微生物的繁殖以增強土壤肥力，使植物處于良好的生長狀態(tài)[16]。目前已有的研究大多是僅針對生防菌提高根際土壤中關鍵酶活性來進行的，本研究中引入枯萎病病菌進行生防菌的拮抗性試驗。前期研究表明[17-19]，3株生防菌的施入不僅具有防病促生長的作用，同時還能提高根際土壤中微生物類群的多樣性。因此，本研究將進一步揭示3株生防芽孢桿菌對黃瓜根際土壤中4種關鍵酶活性的影響，為今后生防芽孢桿菌菌株在農業(yè)生產中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于聊城大學試驗田進行，供試黃瓜品種為津優(yōu)1號。供試菌株為枯萎病病菌（Fusarium oxysporum），由天津科潤黃瓜研究所分離保存;芽孢桿菌B579、2-1、9-2等3株生防菌株均由筆者所在實驗室分離并保存?？莶菅挎邨U菌B579從天津近郊蔬菜種植區(qū)根圍土分離所得，溫室盆栽試驗表明，它對黃瓜枯萎病有顯著的抑制作用，并能促進植物生長;枯草芽孢桿菌2-1從聊城市茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地感染根腐病的丹參根際土壤篩選分離得到，對丹參根腐病具有生物防治作用;解淀粉芽孢桿菌9-2從聊城本地感染根腐病的中藥材天南星的根際土壤中篩選分離得到，對天南星根腐病具有較好的生物防治作用?？菸〔【捎肞DA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基進行培養(yǎng);芽孢桿菌的培養(yǎng)采用LB液體和固體培養(yǎng)基。 酶活性測定選用天根生化科技（北京）有限公司生產的土壤酶活性測定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 菌液培養(yǎng) （1）芽孢桿菌菌液培養(yǎng)：將斜面保藏的生防芽孢桿菌B579、2-1、9-2菌種分別轉入內裝30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)15～16 h，獲得種子液。將1%種子液接種于內裝100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩15～16 h，培養(yǎng)結束后將菌液制備成 1×106 CFU/mL的發(fā)酵液[18]。（2）枯萎病病菌菌液培養(yǎng)：將枯萎病病菌FO在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產生明顯孢子，用無菌水制備成濃度為1×106 個/mL的孢子懸液。

1.2.2 試驗處理 春季培養(yǎng)黃瓜幼苗至2～3張真葉，將幼苗移栽至直徑為30 cm、高為30 cm的花盆中，每盆2～3株幼苗，共計48盆。共設置8組處理，每組6個平行，分別為：① 空白處理（CK），清水澆灌;② 枯萎病病菌處理，枯萎病病菌FO菌液澆灌;③ B579處理，B579菌液澆灌;④ B579+FO拮抗處理，B579菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌;⑤ 2-1處理，2-1 菌液澆灌;⑥2-1+FO拮抗處理，2-1菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌;⑦ 9-2處理，9-2菌液澆灌;⑧ 9-2+FO拮抗處理，9-2菌液+枯萎病病菌FO菌液等量澆灌。①組澆灌清水50 mL，②③⑤⑦組接種量50 mL，④⑥⑧組接種量為生防菌液與枯萎病病菌菌液各50 mL。

1.2.3 菌液灌根處理 在黃瓜根部進行菌液灌根處理。黃瓜在自然條件下，生長周期為90～120 d，其生長發(fā)育一般經歷發(fā)芽期、幼苗期、初花期和結果期4個階段。因此每盆黃瓜從進行菌液澆灌之日算起，分別在4、8、12和16周在各株黃瓜根際土壤約5～15 cm深處取樣，測定土壤堿性磷酸酶（ALP）、過氧化氫酶（AT）、幾丁質酶、脲酶（UE）4種不同酶活性。

2 結果與分析

2.1 不同時期不同處理對黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶活性的影響

由圖1可知，生防菌處理（B579、2-1、9-2）酶活性變化趨勢與空白處理相似，均為在處理后4周和8周升高，在12周和16周降低，即變化趨勢為先升高后降低，且生防菌處理在16周時堿性磷酸酶活性均明顯高于空白處理組，其次為3組拮抗處理，枯萎病病菌FO處理酶活性最低，并且生防菌處理8周后酶活性逐漸降低，因此生防菌在堿性磷酸酶的酶活性中體現出其最佳使用周期為8周。

2.2 不同時期不同處理對黃瓜根際土壤中過氧化氫酶活性的影響

由圖2可知，空白處理組與生防菌B579、2-1和9-2處理基本都為先升高再降低的趨勢，這4種處理酶活性在整個生長期都處于較高狀態(tài)，且在處理12周時均為最高酶活性，而后3種處理在整個生長周期的酶活性均略高于對照，考慮為生防菌益生作用的結果。在8組處理的不同時期，FO處理組過氧化氫酶活性均處于最低狀態(tài)。FO處理與B579+FO，2-1+FO拮抗處理酶活性均處于先降低再升高再降低的趨勢，而9-2+FO拮抗處理則與生防菌處理組變化趨勢相同，含FO的4種處理最后的過氧化氫酶活性基本相同。此結果的原因考慮為在黃瓜的生長過程中生防菌對FO病菌的拮抗作用由強變弱直至消失，對產生過氧化氫酶的微生物影響力逐漸減小，故4種處理過氧化氫酶活性在16周時基本相同。由此可見，由生防菌處理的黃瓜植株根際土壤過氧化氫酶活性在整個處理期均處于較高狀態(tài)，且其最佳使用周期為12周。拮抗處理組酶活性相對較低，但介于生防菌處理組與對照處理組之間，表明生防菌對土壤根際的過氧化氫酶活性能產生積極影響。

2.3 不同時期不同處理對黃瓜根際土壤中幾丁質酶活性的影響

由圖3可知，空白處理組的幾丁質酶活性變化趨勢為先升高再降低，而其他7組處理的酶活性變化趨勢為先升高再降低再升高。FO處理組在16周的酶活性仍低于同時期對照的酶活性。在生防菌（B579、2-1、9-2）處理和生防菌+FO（B579+FO、2-1+FO、9-2+FO）拮抗處理的比較中可以明顯看出，生防菌處理各時期幾丁質的酶活性均高于相應拮抗處理同時期的酶活性（除8周時的9-2）。由此可見，各處理與空白處理對于黃瓜根際土壤中的幾丁質酶活性變化趨勢無太大相似性，而FO處理與各生防菌處理、拮抗處理組具有相同趨勢，且FO處理組的酶活性在各個時期仍為最低，并且生防菌處理8周后酶活性均明顯降低。

2.4 不同時期不同處理對黃瓜根際土壤中脲酶活性的影響

由圖4可知，在處理4周時空白處理組和生防菌處理土壤脲酶活性均較高，且在4個處理中的變化趨勢為先升高再降低再升高。而FO處理與各拮抗處理在4周時土壤脲酶活性均較低，且在4個處理中的變化趨勢基本與前面4組相似，即同為先升高再降低再升高，且8組處理在16周時根際土壤中脲酶活性均處于較高狀態(tài)。

3 討論

研究表明，3種生防芽孢桿菌B579、2-1、9-2均能提高黃瓜根際土壤的酶活性。在黃瓜根際施加生防芽孢桿菌菌液后，僅施加生防菌的3組處理的4種酶活性與空白處理的酶活性相比結果如下：僅施加生防菌的3個不同處理組各個取樣時期的堿性磷酸酶活性明顯高于對照;不同取樣時期過氧化氫酶活性均略高于空白處理，這一結果與曾慶賓等對微生物菌劑對烤煙根際土壤過氧化氫酶活性的研究結果[20]一致，而劉素慧等在EM（有效微生物）對連作大蒜根際土壤酶活性的影響中也得出了相似結論[21];各生防菌處理不同時期的幾丁質酶活性相較于空白處理組在總體上同樣偏高;各生防菌處理組不同時期的脲酶活性與空白處理組相比均有提高，且其變化趨勢與尹淑麗等不同生防菌對黃瓜根際土壤酶活性的研究結果[1]一致。因此，總體上來說，生防芽孢桿菌可提高黃瓜土壤根際的4種不同土壤酶的活性，同時可說明生防菌對于植株的生長具有促生作用。

在用枯萎病病菌FO處理后，可明顯發(fā)現FO處理組不同時期的4種酶活性相較于空白處理組均明顯降低。而各拮抗處理組的酶活性與FO處理組相比較的情況如下：不同時期的B579+FO、2-1+FO與9-2+FO 3組拮抗處理的堿性磷酸酶活性均明顯高于FO處理，且這3組處理的堿性磷酸酶活性高于空白處理組，低于對應的僅加入生防菌的處理組，表明生防菌對于施加了枯萎病病菌的黃瓜根際土壤中堿性磷酸酶活性有較大影響;這3組處理不同時期的過氧化氫酶活性明顯高于FO處理組但低于空白處理組;拮抗處理組不同時期的幾丁質酶活性相較于FO處理組的變化與堿性磷酸酶活性相似，這與王倡憲等對黃瓜苗期根系抗病相關酶活性的研究結果[22]相似;拮抗處理組不同時期的脲酶活性無明顯規(guī)律性，但總體能看出施加生防菌的FO的處理組脲酶活性較僅施加FO處理組高。根據4種不同酶活性的變化，在FO病菌存在的前提下，施加生防菌可提高黃瓜根際土壤的酶活性，聯(lián)系筆者所在實驗室前期研究[17，23]，說明生防菌對于枯萎病病菌存在較明顯的拮抗作用。但對于生防菌防病促生長作用的機制仍需要進一步的研究。

4 結論

在植株根際土壤中施入生防芽孢桿菌菌株可以提高土壤中的酶活性，從而可改善土壤結構，增強土壤肥力，有利于土壤的健康發(fā)展。本研究通過設置多種對照處理研究不同生防菌對不同土壤酶活性的影響程度，表明生防菌不僅在植株生長發(fā)育過程中起到促生作用，而且對可能存在的致病菌起到拮抗作用，能有效防止枯萎病的發(fā)生，為今后生態(tài)環(huán)保型生防菌劑的開發(fā)和利用奠定了理論基礎。

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