程民，毛菊，楊雯雯，吳新春，陳穩(wěn)，徐婷娟，沈國(guó)棟，胡世蓮

[中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)，安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所，腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230001]

共生菌群被喻為呼吸道健康的“看門人(gatekeeper)”，在器官發(fā)育和免疫穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用，腸道共生菌與肺臟關(guān)系密切，在機(jī)體內(nèi)形成“腸-肺”軸，遠(yuǎn)端調(diào)控肺臟免疫穩(wěn)態(tài)[1]。肺泡巨噬細(xì)胞是肺臟內(nèi)最為豐富的固有免疫細(xì)胞，在啟動(dòng)及調(diào)控肺臟免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。共生菌在肺泡巨噬細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)維持及抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用[3-4]，共生菌對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答能力調(diào)控的分子機(jī)制是值得深入研究的科學(xué)問(wèn)題。本研究通過(guò)篩選共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)而探討共生菌群對(duì)荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級(jí))購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，22 ℃，55%濕度，12小時(shí)晝/夜節(jié)奏，所有實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范條例執(zhí)行。

抗菌藥物： 氨芐青霉素、新霉素、萬(wàn)古霉素和甲硝唑等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

細(xì)胞株及培養(yǎng)試劑： LLC細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，DMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶溶液及青霉素-鏈霉素溶液(100×)等購(gòu)自HyClone公司。

流式抗體及細(xì)胞分離試劑等：anti-mouse F4/80(FITC)、anti-mouse CD11c(PE)、anti-mouse CD11b (PerCP-Cy5.5)抗體及同種型抗體購(gòu)自BD公司，大鼠血清購(gòu)自Reanta公司，PBS磷酸鹽緩沖液(干粉)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Percoll溶液購(gòu)自GE Healthcare公司，膠原酶I購(gòu)自Sigma公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogene公司。

1.2 方法 構(gòu)建共生菌缺失小鼠： 使用含有組合抗菌藥物的飲用水連續(xù)飼喂C57BL/6小鼠(5～6周齡，雌性，SPF級(jí))4～6周，建立共生菌缺失小鼠模型。組合抗菌藥物水的配方為含1 g/L氨芐青霉素、1 g/L甲硝唑、1 g/L硫酸新霉素和0.5 g/L萬(wàn)古霉素4種抗菌藥物的飲用水。飼喂期間觀測(cè)小鼠體質(zhì)量變化、活動(dòng)狀態(tài)等，對(duì)體質(zhì)量降低嚴(yán)重(下降30%以上)的小鼠進(jìn)行安樂死，健康對(duì)照組小鼠使用不含抗菌藥物的飲用水進(jìn)行飼喂。

荷Lewis肺癌小鼠模型的構(gòu)建： 利用共生菌缺失小鼠(抗菌藥物水飼喂5周)及正常對(duì)照小鼠(C57BL/6鼠，雌性，10 周齡，SPF級(jí))，尾靜脈注射LLC細(xì)胞(2×106個(gè)/鼠，250 μL PBS)，建立荷Lewis肺癌小鼠模型[3]。

肺泡巨噬細(xì)胞的分離純化： 荷瘤21 d后，取共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠各30只，每組分為2個(gè)樣品，15只小鼠/樣品，摘眼球放血后，脫臼處死，摘取肺臟，去除殘余血管后，將肺臟組織剪碎至直徑小于1 mm，使用DMEM 培養(yǎng)基(含0.1%膠原酶I，5%新生牛血清，100 u/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)重懸，之后37 ℃，200 r/min，消化1 h，將消化液通過(guò)200目的不銹鋼篩網(wǎng)，4 ℃，1 260 g，離心20 min，棄上清。將沉淀用40%的Percoll溶液重懸，輕加于70%的Percoll溶液上，25 ℃，1 260 g(升速1，降速0)，離心30 min，收集40%和70% Percoll溶液界面處的細(xì)胞，1×PBS溶液洗2遍(25 ℃，2 400 r/min，10 min)，大鼠血清封閉后，標(biāo)記熒光抗體，使用流式細(xì)胞術(shù)分選，得到表型為F4/80+CD11c+的肺泡巨噬細(xì)胞。

基因芯片檢測(cè)： 將1.2.3中得到的肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 無(wú)菌Ep管中，1×106個(gè)/管，1 260 g，4 ℃，離心10 min，棄上清，每管加入0.5 mL Trizol試劑溶解細(xì)胞，使用miRNeasy Mini Kit(貨號(hào)217004，Qiagene公司)進(jìn)行RNA抽提，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后，交由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)，所用芯片為SBC-lncRNA(小鼠4×180k)芯片，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

基因芯片結(jié)果分析： 完成雜交的芯片使用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，軟件設(shè)置為Dye channel:Green,Scan resolution=3 μm,PMT 100%,20 bit。用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)，GeneSpring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理，利用變化倍數(shù)及t檢驗(yàn)方法篩選差異基因，篩選條件為變化倍數(shù)≥2，P<0.05?；蚍诸?GO)、KEGG通路分析按照文獻(xiàn)[5-6]方法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin 7.5軟件繪圖并解析。觀測(cè)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以mean±SEM表示，使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各組樣本間的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞之間存在差異性表達(dá)的基因 利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行分選，分選后的肺泡巨噬細(xì)胞(F4/80+CD11c+)純度在98%以上(圖1A)，利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)上述純化后肺泡巨噬細(xì)胞的基因mRNA表達(dá)情況并篩選差異表達(dá)基因，結(jié)果表明，共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞之間差異倍數(shù)≥2的基因共有353個(gè)，其中上調(diào)基因171個(gè)(占48.4%)，下調(diào)基因182個(gè)(占51.6%)，如圖1B和圖1C所示。

2.2 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞差異性表達(dá)基因的功能分析 對(duì)共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞差異性表達(dá)基因(變化倍數(shù)≥2)進(jìn)行了GO及KEGG通路等分析。GO分析的結(jié)果表明，共生菌缺失后荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞差異表達(dá)的基因GO分類主要為細(xì)胞凋亡、趨化作用、血管生成、分泌、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、對(duì)刺激的反應(yīng)性、運(yùn)動(dòng)、信號(hào)、多器官過(guò)程及免疫系統(tǒng)過(guò)程等(圖2A、圖2B)。KEGG通路分析結(jié)果表明，共生菌缺失后荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞差異性表達(dá)基因主要與氮素代謝、趨化因子信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、腫瘤通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路密切相關(guān)(圖2C)。

注：WT+LLC為共生菌正常的荷瘤小鼠；Abx+LLC為共生菌缺失的荷瘤小鼠

圖1共生菌缺失對(duì)荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的影響

圖2 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能分析

2.3 共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中M1/M2型巨噬細(xì)胞特異性基因的表達(dá)情況 對(duì)共生菌缺失荷瘤小鼠及正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中M1和M2型巨噬細(xì)胞特異性基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞特異性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等表達(dá)上調(diào)(變化倍數(shù)≥2)，M1型巨噬細(xì)胞特異性基因CCL8表達(dá)上調(diào)(變化倍數(shù)≥2)，IL-12A基因表達(dá)下調(diào)(變化倍數(shù)≥2)。見圖3。

3 討論

呼吸道是一個(gè)復(fù)雜的黏膜組織，從鼻腔到肺泡(上呼吸道和下呼吸道)均有特定的共生菌群，在維持肺臟健康以及在呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[7]，腸道共生菌亦可遠(yuǎn)端調(diào)控肺臟免疫穩(wěn)態(tài)及免疫應(yīng)答。肺臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞按照其所在位置分為肺泡巨噬細(xì)胞、間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞及游離在肺臟血管內(nèi)的巨噬細(xì)胞[8]，肺泡巨噬細(xì)胞具有F4/80+CD11c+巨噬細(xì)胞表型，是肺泡腔表面分布最為豐富的固有免疫細(xì)胞，作為機(jī)體抵御病原體和污染源的第一道防線，啟動(dòng)及調(diào)控肺臟的免疫應(yīng)答[2]。肺泡巨噬細(xì)胞較肺臟間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的清除微生物感染的能力，能夠產(chǎn)生高水平的活性氧中間體(ROI)、NO、TNF-α和細(xì)胞毒性，參與多種肺臟疾病的發(fā)生發(fā)展。共生菌對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的表型及功能具有重要作用，呼吸道共生菌信號(hào)調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞的功能和極化狀態(tài)[4,9]，腸道共生菌信號(hào)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的功能亦具有重要的調(diào)控作用[10-12]，已有研究證實(shí)腸道共生菌來(lái)源的信號(hào)是建立巨噬細(xì)胞活化閾值所必不可少的免疫刺激[13]。在外部環(huán)境信號(hào)刺激下，巨噬細(xì)胞發(fā)生M1或M2型極化，M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒活性和抗腫瘤活性，M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能、促進(jìn)Th2細(xì)胞活化、參與組織修復(fù)等。

本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，共生菌缺失小鼠較正常小鼠更易發(fā)生肺部腫瘤(黑色素瘤及Leiws肺癌)，并且明確了共生菌缺失小鼠接種黑色素瘤后肺泡巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的變化情況，但共生菌缺失對(duì)接種Leiws肺癌小鼠肺泡巨噬細(xì)胞基因表達(dá)的影響尚不明確[2,4]。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)分選共生菌缺失荷Leiws肺癌小鼠及正常荷Leiws肺癌小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，利用基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，共生菌缺失荷瘤小鼠與正常荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞之間存在353個(gè)差異表達(dá)的基因(差異倍數(shù)≥2)，上調(diào)基因171個(gè)(占48.4%)，下調(diào)基因182個(gè)(占51.6%)；M2型巨噬細(xì)胞特異性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等在共生菌缺失荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(變化倍數(shù)≥2)，M1型巨噬細(xì)胞特異性基因CCL8表達(dá)上調(diào)、IL-12A基因表達(dá)下調(diào)(變化倍數(shù)≥2)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因GO分類主要集中在細(xì)胞凋亡、趨化作用、血管生成、分泌、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、對(duì)刺激的反應(yīng)性、運(yùn)動(dòng)、信號(hào)及免疫系統(tǒng)過(guò)程等方面。同時(shí)，差異表達(dá)基因與氮素代謝、趨化因子信號(hào)、TGF-β信號(hào)、腫瘤、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等KEGG通路密切相關(guān)。

注：WT+LLC為共生菌正常的荷瘤小鼠；Abx+LLC為共生菌缺失的荷瘤小鼠

本研究發(fā)現(xiàn)共生菌可以調(diào)控荷瘤小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中基因的表達(dá)水平，共生菌缺失導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞特異性基因CCL24、Arg1、Retnla及IL-13等表達(dá)上調(diào)。共生菌缺失導(dǎo)致的差異性表達(dá)基因與細(xì)胞凋亡、趨化、血管生成、分泌、分化、增殖等GO分類及趨化因子、腫瘤等KEGG通路密切相關(guān)，上述結(jié)果為深入探討共生菌在肺泡巨噬細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)維持及抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用及機(jī)制提供了重要依據(jù)和參考。