李開(kāi)金，馮婷婷，黃曄，林奇泗

（徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004）

深裂竹根七[Disporopsis pernyi（Hua）Diels]為百合科竹根七屬植物，它生長(zhǎng)在海拔500 m～2 500 m 的南亞地區(qū)[1]。這種植物具有悠久的藥用歷史，用于治療慢性咳嗽、炎癥等病癥，但尚未被成功地進(jìn)行人工栽培[2]。根據(jù)本課題組以往的研究表明，深裂竹根七乙酸乙酯提取物的抗氧化和抗菌作用強(qiáng)于氯仿、石油醚和正丁醇提取物，且其酚酸成分的活性較強(qiáng)[3]。因此，本研究選擇深裂竹根七的乙酸乙酯提取物為研究對(duì)象。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，從深裂竹根七中分離出了蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸[4-5]。而液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)是酚類(lèi)化合物分析的重要分析技術(shù)之一。其中飛行時(shí)間質(zhì)譜（time-offlight mass spectrometry，TOF-MS）可以在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)提供極好的質(zhì)量準(zhǔn)確度[6]。因此本研究采用液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)這4 種酚酸成分進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其是否存在于乙酸乙酯提取物中，并用超高效液相色譜進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與材料

新鮮的深裂竹根七于2016年8 月從高山地區(qū)采集，地址位于貴州?。ń?jīng)度 106°56′～106°68′E；緯度26°42′～26°43′N(xiāo)；海拔 1 000 m～1 600 m）。將干燥的植物原料粉碎，過(guò)二號(hào)篩，風(fēng)干備用。

沒(méi)食子酸（批號(hào)110831-201704）、蘆?。ㄅ?hào)100080-201707）、木犀草素（批號(hào) 111520-201704）、槲皮素（批號(hào)100081-201703）、樺木酸（批號(hào)100135-201707）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；福林酚試劑（色譜純）：上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜級(jí)）：Caledon 實(shí)驗(yàn)室（加拿大喬治敦）；超純水：杭州娃哈哈集團(tuán)；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等試劑均為分析純：山東禹王試劑公司。

Shimadazu Nexera X2 30A 超高效液相色譜：日本島津公司；BSA124S 型電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TG332A 型微量分析天平：上海分析天平廠；Agilent UPLC/Q-Tof 液質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent1200系列高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

2 方法

2.1 乙酸乙酯提取物制備

深裂竹根七風(fēng)干粉末（50 g）用500 mL 70%乙醇在90 ℃下提取1 h，重復(fù)3 次。合并濾液，將濾液于60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味。以乙酸乙酯為溶劑，采用液-液萃取法萃取乙醇提取物。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)得到乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extraction，EAE）。EAE 的收率為1.9%，將其保存于4 ℃下備用。

2.2 總酚含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

參考文獻(xiàn)方法[7-8]，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，用Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定EAE 中總酚含量。分別取100、200、300、400、500 mg/L 沒(méi)食子酸 80%甲醇溶液 50 μL，分別與 450 μL 的蒸餾水和 2.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑混合。5 min 后，加入 2 mL 飽和碳酸鈉（75 g/L）在30 ℃間歇振蕩培養(yǎng)1.5 h 后，在765 nm 處測(cè)量所得藍(lán)色溶液的吸光度。以含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回歸方程。

2.2.2 供試品含量的測(cè)定

取EAE 適量溶解在甲醇中定容，取50 μL 按2.2.1項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算?？偡雍恳詻](méi)食子酸干燥物質(zhì)量計(jì)，單位為mg/g。

2.3 液質(zhì)聯(lián)用法鑒別EAE 中酚酸

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相A 和B 分別為水和乙腈，梯度程序?yàn)椋?5 %～90 % A 保留 10 min，90 %～60 % A 保留30 min，60 %～40 %A 保留 10 min，40 %～30 %A 保留5 min，30 %～20 %A 保留 10 min，20 %～10 %A 保留5 min，10%A 保留10 min。每次分析后再平衡時(shí)間為10 min。流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），分析的參數(shù)設(shè)置在負(fù)離子模式下，在從M/Z 50～1 000的質(zhì)量范圍內(nèi)獲得的光譜。最佳ESI-MS 參數(shù)為：毛細(xì)管電壓3.5 kV，干燥氣體溫度180 ℃，干燥氣體流量8 L/min，霧化氣體壓力1.2 psi（1 psi=0.006 89 MPa）。

2.3.3 對(duì)照品溶液配制

精密稱(chēng)取蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加甲醇制成濃度約為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液。

2.3.4 樣品檢測(cè)

取2.3.3 項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液在上述色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析。

供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取2.1 項(xiàng)下EAE 適量，加入色譜純甲醇溶解定容，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液在2.3.1 項(xiàng)下色譜和2.3.2 項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。

2.4 超高效液相色譜分析4 種酚酸含量

2.4.1 色譜條件

色譜柱為 Shim-pack XR-ODS column （1.6 μm，75 mm×2.0 mm）；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；二極管陣列檢測(cè)器 Photodiode Array Detector；檢測(cè)波長(zhǎng)：210、254 nm 和 280 nm。流動(dòng)相 A 和 B 分別由0.1 % 甲酸溶液（pH 2.4）和乙腈組成。梯度順序?yàn)椋?5 %A 保留 2 min；95 %～90 %A 保留 2 min；90 %～60 %A 保存 6.5 min；60 %～40 %A 保存 2 min；40 %～30 %A 保存 1 min；30 %～20 %A 保存 2 min；20 %～10 %A 保存 1 min；10%A 保存 3 min。每次分析后再平衡時(shí)間為10 min。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

分別精密量取2.3.3 項(xiàng)下4 種酚酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇溶解并逐級(jí)稀釋至刻度，制成系列濃度的對(duì)照品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以各色譜峰的峰面積A 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。

2.4.3 方法學(xué)考察

分別考察精密度、重現(xiàn)性、24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性及回收率。

2.4.4 樣品含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)定3 批2.1 項(xiàng)下EAE 適量，加甲醇配制成溶液，按2.4.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣，將峰面積代入回歸方程，計(jì)算含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 總酚含量

提取物中的總酚含量由校準(zhǔn)曲線(xiàn)導(dǎo)出的回歸方程（y=24.02x-0.053，R＝0.999 3）。將樣品吸光度代入回歸方程計(jì)算，EAE 含量為（35.3±1.03）mg/g。結(jié)果表明，深裂竹根七乙酸乙提取物中含有大量的酚類(lèi)化合物。

3.2 液質(zhì)聯(lián)用法分析酚酸成分

用反相高效液相色譜與電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜分析法從EAE 檢測(cè)出了4 種酚類(lèi)化合物，因?yàn)槭褂玫氖秦?fù)離子模式，故所得的離子為[M-H]-。所獲得的離子流圖如圖1 所示，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 基峰離子流圖Fig.1 The base peak chromatogram

表1 EAE 中4 種成分峰的HPLC-ESI Q-TF-MS 數(shù)據(jù)Table 1 HPLC-ESI-Q-TOF-MS data for EAE

3.3 超高效液相色譜法測(cè)定4種酚酸含量

測(cè)定將供試品峰面積代入回歸方程，方法學(xué)考察和回歸方程見(jiàn)表2，色譜圖見(jiàn)圖2。

深裂竹根七乙酸乙酯提取物中蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸的含量分別為 （5.63±0.15）、（2.51±0.10）、（3.87±0.12）、（2.41±0.09）μg/g，結(jié)果以干重計(jì)。

本研究采用反相高效液相色譜與電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜分析聯(lián)用技術(shù)對(duì)深裂竹根七EAE 中4 種酚類(lèi)化合物進(jìn)行了分離和鑒定。質(zhì)譜法檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)包括確定分子量和獲得結(jié)構(gòu)信息的能力。酚類(lèi)化合物的響應(yīng)靈敏度對(duì)負(fù)離子極性較好，因?yàn)榉宇?lèi)化合物的酚羥基或羧基容易與溶液中的陰離子解離。因此，采用了負(fù)離子模式進(jìn)行分析。

表2 4 種化合物的方法學(xué)考察Table 2 Methodology of the four analytes

圖2 乙酸乙酯提取物超高液相色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of EAE

本研究采用UPLC 法測(cè)定了深裂竹根七中的蘆丁、木犀草素、槲皮素和樺木酸4 種成分含量。這4 種組分曾被文獻(xiàn)報(bào)道用系統(tǒng)分離法分離得到。故而本研究針對(duì)這4 種成分建立含量測(cè)定方法。曾使用高效液相法測(cè)定這4 種成分，需要費(fèi)時(shí)90 min，而改用UPLC法只需20 min，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。