林 妃 李敬陽 何應對 王麗霞 黃東梅 殷曉敏 劉永霞 王必尊

(中國熱帶農業(yè)科學院?？趯嶒炚?海南省香蕉健康種苗繁育工程技術研究中心 海南?？?71101)

地瓜又名白薯、甘薯、山芋、紅芋、番薯、紅薯，為旋花科甘薯屬一年生或多年生蔓性草本植物，富含蛋白質、淀粉、果膠、纖維素及多種礦物質，有“長壽食品”之譽，是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物，在世界糧食生產總產量中排列第7位［1-3］。澄邁橋頭富硒地瓜可以說是地瓜屆的王者，它還有一個雅號—“長壽瓜”，其富含各種維生素、膳食纖維、淀粉、鉀、鈣等物質，營養(yǎng)豐富，甜度適中，且含硒元素特別高，可補虛、健脾、抗胃癌，是地瓜中的珍品，備受喜愛。

甘薯是中國重要的農作物，年產量僅次于水稻、小麥和玉米。然而，甘薯病毒病卻一直影響著甘薯的產量，極大地阻礙了甘薯產業(yè)的發(fā)展，中國每年因甘薯病毒病造成的產量損失價值高達40億元，此問題一直困擾著很多從事此方面研究的科技人員。甘薯病毒有多種，其中，甘薯卷葉病 毒 （sweetpotato leaf curl virus， 簡 稱SPLCV）是引起甘薯產量大幅降低的主要病原之一，SPLCV可引起甘薯葉片上卷、植株矮化等，在自然條件下由昆蟲介體煙粉虱通過持久方式進行傳播，也可通過嫁接方式進行傳播［4-5］。

地瓜為無性繁殖作物，主要通過蔓秧、種薯和苗繁殖，病毒易在體內積累，從而逐年加重，造成減產，與其它無性繁殖作物一樣，其產量受到病毒病的嚴重威脅。病毒病大田發(fā)病率達40%～60%，造成減產15%以上，嚴重時可達50%～80%，且有加重與蔓延的趨勢［6～8］。目前對植物病毒病尚無有效的防治藥劑，應用植物莖尖分生組織培養(yǎng)技術生產脫毒苗是防治病毒病最有效的途徑。國內外的研究表明，甘薯通過莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗，能顯著提高產量［9-11］，增幅在 14.6%～43.4%［12］，并能改善塊莖品質［13］和品種的特性。近年來，澄邁橋頭地瓜由于受病毒病的影響，產量嚴重下降，舊地不能繼續(xù)種植地瓜，大幅縮小橋頭地瓜的種植面積。解決澄邁橋頭地瓜種苗脫毒問題是確保地瓜產量提高的有效途徑。試驗選取海南省澄邁橋頭地瓜作為供試品種，開展澄邁橋頭富硒地瓜脫毒苗繁殖技術的研究，為澄邁橋頭地瓜脫毒苗工廠化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗時間、地點

試驗于2017年在中國熱帶農業(yè)科學院海口實驗站熱帶植物繁殖技術研究中心進行。

1.1.2 試驗材料

選取無病蟲害、表面光滑無損傷的海南澄邁橋頭富硒地瓜（簡稱橋頭地瓜）為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體準備

將采回的橋頭地瓜置于26℃左右環(huán)境下催芽，待芽萌發(fā)至5～8 cm時將芽剪下，剪去已展開的葉片，留下3 cm左右的頂芽。

1.2.2 外植體消毒

將頂芽用洗衣粉水清洗一遍，自來水沖洗30 min，置于無菌操作臺備用。在無菌操作臺上先用無菌水清洗2～4遍，把水倒干，放入75%酒精里不停搖晃1 min；用無菌水清洗2～4遍，再置于0、1‰、2‰、3‰的升汞溶液中浸泡15 min，不時搖晃，然后用無菌水清洗3～5遍，備用。

1.2.3 地瓜莖尖誘導培養(yǎng)

將消毒好的頂芽去掉葉片、莖段枝條，取莖尖生長點快速接種到含不同濃度激素的培養(yǎng)基誘導（表1）。以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度激素6-B、IBA，每種培養(yǎng)基接種50個外植體，置于26～30℃暗培養(yǎng)5 d，轉為光照培養(yǎng)，每天光照12～14 h。

表1 不同莖尖誘導培養(yǎng)基配方

1.2.4 繼代培養(yǎng)

將莖尖誘導出來的橋頭地瓜脫毒苗用Frison等［14-15］的方法證明為無毒組培苗，將其作為繼代培養(yǎng)材料。切取帶芽的脫毒苗莖段接種到繼代培養(yǎng)基中（配方為誘導莖尖篩選的培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L）；置于25～28℃條件下暗培養(yǎng)5～7 d，之后在光照14h/d、光強度1 500～1 800 lx條件下培養(yǎng)。

1.2.5 壯苗生根試驗

待繼代培養(yǎng)脫毒苗長至3 cm左右高時，切取單苗接種到含不同濃度激素的培養(yǎng)基上，置于光照16h/d、光強度1 500～1 800 lx條件下培養(yǎng)，觀察橋頭地瓜單芽在不同濃度激素中的壯苗生根情況。不同生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA。

2 結果與分析

2.1 不同升汞濃度對橋頭地瓜頂芽消毒的影響

由表2可見，2‰的升汞消毒效果最佳，其污染率最低（15%），褐化率較低（18%）；對照污染率100%；升汞濃度為1‰時褐化率最低，但是污染率達到65%；升汞濃度為3‰時污染率最低（10%），但褐化嚴重，達到63%。綜合考慮，將2‰升汞濃度作為橋頭地瓜外植體最適宜消毒濃度。

2.2 不同濃度6-BA對橋頭地瓜莖尖誘導的影響

將消毒好的地瓜頂芽去掉多余的葉片及莖段，留取莖尖生長點，分別接種到A1、A2、A3和A4誘導培養(yǎng)基中，每天觀察記錄試驗情況。第10天時A2和A3誘導出1～2個新芽，A1沒有新芽，A4外植體周圍有愈傷形成，A5外植體周圍生成大量的愈傷。第15天時A1培養(yǎng)基中的外植體形成單芽，誘導率達到76%（表3）；A2培養(yǎng)基中的外植體長出1～5個新芽，誘導率達到83%；A3培養(yǎng)基中外植體誘導出5個以上的新芽，誘導率達到100%；A4培養(yǎng)基中外植體愈傷組織膨大，形成的叢生芽數量多，加上愈傷多，難以形成植株，誘導率只有43%；A5培養(yǎng)基中外植體形成大量愈傷并褐化，誘導率低，只有23%，難以形成植株（圖1）?？梢娮钸m合地瓜莖尖誘導的培養(yǎng)基為A3，不加激素的情況下（對照）地瓜莖尖只有單芽形成，隨著激素6-BA濃度的升高，誘導的叢生芽增多，而激素6-BA濃度過高時叢生芽雖多，愈傷也多，難以形成單芽植株。因此，并不是激素6-BA濃度越高越好。試驗證明，最合適橋頭地瓜莖尖誘導的培養(yǎng)基為A3。

表2 不同濃度升汞對莖尖消毒的影響

表3 不同濃度6-BA對橋頭地瓜莖尖誘導的影響

圖1 不同培養(yǎng)基誘導地瓜莖尖叢生芽

2.3 繼代培養(yǎng)

將莖尖誘導出來的橋頭地瓜組培苗用Frison等［14-15］的方法檢驗，證明其為無毒組培苗后，將其作為繼代培養(yǎng)材料。切取小苗帶芽莖段接種到繼代培養(yǎng)基中，7 d左右有大量叢生芽形成，15 d左右長成3～5 cm的單個植株，即可用于生根培養(yǎng)。

2.4 不同濃度NAA對橋頭地瓜組培苗壯苗生根的影響

誘導生根培養(yǎng)基以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素為NAA，設計4個濃度水平。地瓜為草本植物，生根容易。不添加激素的情況下（對照），地瓜組培苗也能生根，但生根時間長，10 d后才開始有根形成。添加激素NAA濃度為0.1 mg/L時，第3天就開始有根長出，7 d左右形成大量的根，苗粗壯，10～12 d就能連苗移栽；添加激素NAA濃度為0.2 mg/L時，3 d后有大量根長出，根的周圍有愈傷形成，造成根的褐化；添加激素NAA濃度為0.3 mg/L時，5 d后才有根長出，根蓬松，愈傷多，褐化嚴重。試驗結果表明，當添加激素NAA濃度為0.1 mg/L時最合適地瓜組培苗壯苗生根。

3 討論與結論

本試驗表明，地瓜組培苗在基礎培養(yǎng)基1/2 MS中不添加激素也能生根，與劉玉敬等［5］報道（甘薯無毒苗快繁采用無生長調節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)就能順利生長）相同。但是不加激素生根時間長，在添加激素NAA濃度為0.1 mg/L時最適合生根，生根時間短，第3天就有根形成，10～12 d就能連苗移栽，苗粗壯，根基部不形成愈傷；添加激素大于0.1 mg/L時基部有愈傷形成，影響生根時間及根數量，且根褐化。激素濃度越高愈傷越多，褐化越嚴重，這與前人研究結果相符，即激素濃度相對降低，可縮短了生根時間，且節(jié)約了生產成本，更有利于工廠化育苗。

本研究中，澄邁橋頭地瓜莖尖誘導選擇的激素組合為6-BA和IBA，這與顧淼［3］報道相同，只是所選擇的濃度不同，獲得的誘導率不一致，本研究縮短了莖尖的誘導時間，誘導率高、苗粗壯。本研究結果證明，用配方A3誘導橋頭地瓜莖尖，15 d就能形成5個以上的芽，15 d誘導率達到100%，可用于繼代或生根培養(yǎng)。激素6-BA濃度的高低對橋頭地瓜莖尖生長點的誘導有很大的影響，不添加激素，只能誘導成單芽；6-BA濃度在0～2 mg/L，誘導率隨著濃度的增大而提高，叢生芽數量增多，但是6-BA濃度大于2 mg/L時，誘導率隨著激素6-BA濃度的增加反而減少，愈傷多，形成植株數量少。

通過對澄邁橋頭地瓜莖尖進行誘導試驗，獲得了一套澄邁橋頭地瓜脫毒組培苗快速繁殖方法：用2‰升汞對外植體進行消毒；莖尖生長點誘導不定芽的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L；繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；最佳壯苗生根誘導培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。