劉芳 張琳 張志信 張四純

摘要：基質輔助激光解吸電離質譜作為一種軟電離質譜技術，可快速、可靠地從植物組織中獲得分子組成結構信息，還可以通過成像的方式獲得成分分布信息，因此在藥用植物分析中受到了越來越多的關注。本文對基質輔助激光解吸電離質譜成像技術及其在藥用植物分析中的應用進行了總結和展望。

關鍵詞：基質輔助激光解吸質譜成像;藥用植物;直接分析;評述

1引言

藥用植物作為藥物開發(fā)的重要資源受到了越來越多的重視，其成分分析成為生化、制藥和臨床研究的重要課題[1]。隨著儀器分析技術的發(fā)展，紫外光譜（UV）[2]、紅外光譜（IR）[3～5]、拉曼光譜（RamanSpectrum）[6]、色譜（GC/HPLC）[7～9]、質譜（MS）[10]和核磁共振光譜（NMR）[11]等技術被廣泛用于藥用植物鑒定、化學成分分析及指紋圖譜的建立，推動了藥用植物成分定性和定量分析的研究。其中，質譜技術因具有較高的分辨率、選擇性和靈敏度成為藥用植物質量控制、活性成分篩選及藥理毒理研究的有效工具。

基質輔助激光解析電離質譜（MALDI-MS）是20世紀80年代后期發(fā)展起來的一種“軟”電離質譜技術，具有碎片少、靈敏度高、分辨率高和高通量等特點，非常適用于復雜樣品體系研究[12]。采用MALDI-MS分析蛋白質、多肽等生物大分子時，可直接分析完整的蛋白質分子，并具有高靈敏度、高離子傳輸和高采集速率的優(yōu)點，在生物化學領域得到了極大的關注，成為蛋白質組學研究的有利工具[13]。新型基質材料和基質抑制劑以及無基質材料的使用推動了小分子化合物的MALDI-MS檢測的發(fā)展，此項技術的應用范疇也進一步擴展。MALDI-MS與成像技術結合，通過對組織切片表面的掃描，實現(xiàn)了組織中的分子（如蛋白質、多肽、代謝產物）的原位分析，獲得了其空間分布信息，在藥用植物分析中具有很大的應用潛力。已有一些綜述文章對各種質譜成像技術在植物內源性分子原位表征中的應用進展進行了介紹[14]。本文主要針對MALDI-MS成像技術在藥用植物分析中的應用進行了評述，對該領域的研究工作進行了總結和展望。

2基質輔助激光解吸質譜成像技術

2.1MALDI-MS的原理

目前被廣泛采用的MALDI-MS技術主要是MALDI與飛行時間質量分析器（Timeofflight，TOF）兩者的組合，工作原理如圖1所示。樣品與基質先形成共結晶，激光（337nm的氮激光或355nm的固體激光）照射后，基質吸收大部分的激光能量，將樣品分子送入氣相。同時，吸收能量后的基質瞬間由固態(tài)變成氣態(tài)，形成基質離子。被分析物與基質離子相互碰撞的過程中，通過能量交換離子化。帶電荷的離子在飛行時間質量分析器中按照質荷比（m/z）的不同先后到達檢測器進行檢測[15]。離子化過程中，基質先吸收激光的能量，然后再傳遞給樣品，對樣品起到了保護作用，所以離子化條件比較溫和;其次，高濃度的基質將樣品分子彼此分開，減弱了樣品分子之間的相互作用，使被分析物不容易形成簇群，因此它是一種軟電離技術，并具有高耐鹽、靈敏度高、準確度高等特點，適用于大分子物質和復雜樣品的測定。

2.2MALDI-MS的基質選擇

在MALDI-MS技術中，基質對樣品的離子化起至關重要的作用，不同基質對分析物的離子化效率不同。近年出現(xiàn)了大量適用于生物大分子分析的基質，如α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid）、2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxyben-zoicacid）、2，5-二羥基苯乙酮（2，5-Dihydroxyacetophenone）、芥子酸（3，5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid）、3-羥基吡啶甲酸（3-Hydroxypicolinicacid）。但上述基質大多在低分子量區(qū)域產生離子峰，使得小分子物質的檢測受到了限制。隨著碳、硅、納米金等無機材[16]，新型有機分子基質[17]的出現(xiàn)，以及基質抑制劑[18]和無基質材料[19]的使用，小分子化合物的MALDI檢測成為了可能[20～22]，此技術在藥用植物分析中的應用也得到了進一步的發(fā)展。

2.3MALDI-MS成像的操作流程

MALDI-MS成像（MALDI-MSI）的一般過程如圖2所示：在低溫（-16～-20℃）環(huán)境下，使用冷凍切片機將樣品進行切片，獲取厚度為10～20μm的組織切片;將該組織切片用激光掃描儀進行掃描，選用合適的基質，借助于基質噴涂儀將其均勻覆蓋于組織切片表面，使基質與分析物在原位形成共結晶。隨后，將裝載了組織切片的靶板送入質譜儀進行質譜成像。

由MALDI-MSI的原理和操作流程可知，與其它藥用植物分析技術相比，MALDI-MSI具有以下特點[23，24]：可對植物組織切片直接進行分析，樣品制備過程簡單;獲取組織空間分布圖像時不需對組織中的檢測分子進行體外標記或染色，操作方便;具有較高的檢測靈敏度及較強的分子鑒定能力，測定時可在組織切片中同時找到多種分子，并提供這些分子在組織中空間分布的信息，為尋找、闡明和鑒定重要分子等提供了快速、原位、可視化的結果。

2.4MALDI成像與其它質譜成像技術的比較

除MALDI-MSI外，質譜成像技術還有很多種，目前應用較多的是二次離子質譜成像（Secondaryionmassspectrometryimaging，SIMSimaging）和解吸電噴霧離子化質譜成像（Desorptionelectrosprayionizationmassspectrometryimaging，DESI-MSI）。這兩種質譜成像方法的電離方式和MALDI不同，都無需基質，避免了基質質譜峰的干擾，同時還避免了由基質對樣品的溶解所引起的待測分子移位現(xiàn)象，確保了質譜成像的準確性。然而，DESI-MSI的空間分辨率較低，僅為100～200μm，并且難以實現(xiàn)對蛋白質大分子和非極性物質的解離。SIMSimaging是目前空間分辨率最高的質譜成像方法，可達50nm，但它的電離方式易產生碎片離子，而且對分子量>2kD的分析物顯現(xiàn)出較低的靈敏度[25，26]。

相比而言，MALDI-MSI可測定的分子質量范圍最寬，但空間分辨率不及SIMSimaging。Soltwisch等[27]通過使用波長可調諧的位置化激光器在氣相中二次引發(fā)類似MALDI的離子化過程，提高了電離效率，同時分辨率也達到了微米級以下。目前，MALDI-MSI還存在不適合樣品定量分析的問題。這是由于基質與樣品形成的共結晶在組織切片上分布不均勻，以及激光會剝蝕結晶表面造成樣品的損耗等原因造成的[28]。

3藥用植物的MALDI-MSI分析

MALDI-MS的軟離子化方式對待測物的破壞很小，形成的離子多是單電荷離子，譜圖解析更容易，因此在藥用植物相關領域逐漸得到關注[29～32]。對藥用植物成分進行分析時，以往需要將藥用植物研磨成粉末，然后選用合適的溶劑來進行提取、分離和純化，純化后的成分進行測定。提取時常需采用不同的溶劑，并通過色譜進行分離，樣品制備過程復雜費時，導致活性成分被損壞或損失。而且，通過單一的樣品制備過程也不能將藥用植物中的活性成分完全提取出來，導致了分析結果的不準確性。因此，對藥用植物組織的化學成分進行直接分析顯得尤為重要。

3.1藥用植物MALDI-MSI分析的制備技術

藥用植物的MALDI-MSI分析是否能獲得高質量的質譜與樣品的制備技術密切相關[33，34]。組織切片的制備是MALDI-MSI的關鍵環(huán)節(jié)之一。冷凍切片因具有快速、簡便、易操作、易于保持組織原有形態(tài)等優(yōu)點，成為MALDI-MSI樣品切片的首選方法[35]。植物細胞因有細胞壁和大液泡，含水量較多，在低溫冷凍過程中容易形成冰晶。對于不同的植物，甚至同一植物的不同器官，其質地及含水量的差異也較大，因此給切片過程造成了困擾[36～38]。

通常植物組織在切片前先將其在-80℃冷凍，冷凍后的樣品使用冷凍切片包埋劑（OCT）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）或水進行固定[39]。使用OCT時只能固定樣品，不能將樣品包埋起來，因為OCT含有的多聚物會嚴重干擾質譜測定。切片溫度選擇-16～-20℃時可獲得厚度為10～20μm的完整切片，溫度過低易導致植物組織片破碎。組織切片越薄，圖譜質量越好。

切片后將基質溶液均勻地覆蓋于組織切片表面，與組織表面分子形成良好的共結晶?；|覆蓋的方法主要有3種：手動噴涂、全自動噴霧和真空升華[40]。Huang等[41]利用一個小型加濕器沉積基質，不但成本低廉，而且獲得了直徑<10μm的基質晶體，提高了靈敏度。目前，還出現(xiàn)了利用多孔納米材料開發(fā)出來的離子化輔助基板[19]，利用毛細作用使待測樣品的分子上升到組織切片表面，實現(xiàn)成像分析。這種離子化輔助基板的使用省略了基質覆蓋的操作步驟，極大縮短了樣品的處理時間。但只適用于小分子化合物的分析，并且離子化的機理還不清楚。

3.2MALDI-MSI在藥用植物分析中的應用

MALDI是研究內源性代謝產物的有力工具。Wu等[42]對4種藥用植物進行了MALDI-MS測定，結果表明，使用MALDI-MS直接分析藥用植物切片，進而可快速提供可靠有效成分信息。這種從植物組織的直接分析中快速收集信息的方法，對于新化合物的發(fā)現(xiàn)和藥用植物的質量控制具有重要價值。Ng等[43]在MALDI-MS對藥用植物組織直接測定的基礎上，通過改良MALDI靶板，記錄激光照射植物組織時垂直和水平軸的位置，然后根據(jù)不同產地青藤莖部組織區(qū)域徑向距離對應的6種代謝物的質譜信號（圖3），發(fā)現(xiàn)不同生長區(qū)域的青藤莖部3種代謝物（m/z356、342和314）呈特異性空間分布，其它代謝物則沒有表現(xiàn)出這種特點。這項研究表明，MALDI-MS是一種對藥用植物代謝物空間分布研究具有潛力的方法。

在專門的成像軟件控制下，目前的MALDI-MSI技術就可實現(xiàn)采集數(shù)據(jù)后自動成像的功能，并同時提供樣本表面多種分子組成、豐度及原位空間分布信息，因此，該項技術在藥用植物研究方面凸顯優(yōu)勢，已逐漸成為質譜領域的研究新趨勢之一（表1）。

MALDI-MSI用于人參皂苷的研究較多，Taira等[44]用MALDI-MSI觀測了人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rf的分布，發(fā)現(xiàn)人參皂苷在側根皮層和周皮中的分布比髓質多。同時，皂苷在根尖（直徑2.7mm）處的分布多于根的中心（直徑7.3mm）。原人參二醇型人參皂苷（Rb1、Rb2、Rc）與原人參三醇型皂苷（Rf）的分布量也存在差異。Bai等[48]利用MALDI-MSI建立了一種簡單、可靠的方法直接檢測人參組織中的皂苷，共檢測到20種原人參二醇型皂苷、7種原人參三醇型皂苷、1種齊墩果酸型皂苷以及3種其它類型皂苷，并通過MALDI-TOFMS/MS進行了鑒定。這些皂苷依據(jù)人參根部的植物學結構，明顯呈現(xiàn)出5種獨特的分布模式（圖4），這可對特定組分的提取提供幫助。同時，以1117.5和1147.5兩處譜峰為依據(jù)，將形貌相似而年齡不同的3種人參區(qū)分開來。Wang等[57]以3種人參屬的藥用植物人參、西洋參和三七為樣品，利用MALDI-MSI檢測到了51種皂苷，并給出了它們的分布位置，發(fā)現(xiàn)皂苷的分布模式和富集位置在不同參類中有著巨大的差異。并通過對富集位置數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA），篩選出了16種鑒別參類的有效標志物，實現(xiàn)了對3種不同人參屬藥物的快速鑒別。

長春花因含有抗腫瘤活性的萜類吲哚生物堿（TIA）而聞名。Yamamoto等[52]利用MALDI-MSI和活體單細胞質譜研究了TIA在長春花莖中的特異性分布。質譜成像表明，大部分TIA位于異細胞和乳管中。他們還討論了TIA在異細胞以及乳管中合成與累積的意義，對藥用植物次生代謝產物其它方面的研究提供了參考。Heskes等[54]在利用MALDI-MSI尋找到穗花牡荊中二萜類化合物主要分布于果實和葉子毛狀體的基礎上，通過對毛狀體特異性轉錄組數(shù)據(jù)庫的分析，鑒定出參與二萜化合物生物合成的7個候選基因。Kusari等[47]以金絲桃屬植物為研究對象，采用高分辨率MALDI-MSI技術對兩種金絲桃屬植物葉片的金絲桃素及其前體化合物的分布進行了研究。通過與不含金金絲桃素的植物中相同前體物-大黃素分布的比較，證實了金絲桃素的生物合成理論。同時也對另一種前體物質大黃素蒽酮的分布和合成進行了分析。這項研究工作為進一步研究金絲桃素生物合成途徑提供了理論依據(jù)，也為藥用植物代謝物的生物合成途徑研究提供了參考。

Beck等[50]利用MALDI-MSI技術得出了銀杏葉中黃酮苷的分布情況，用于研究生物/非生物脅迫和防御機理對分布的特異性進行闡述。黃酮苷分布于葉片的各個部位，但維管束附近含量較高，因為只有在葉片內部均勻分布的情況下，葉片的紫外線防護功能才能發(fā)揮作用。同時，他們還發(fā)現(xiàn)雙黃酮類化合物主要位于葉片的表面，而雙黃酮被認為是一種真菌毒素，對昆蟲也具有威懾力的物質，根據(jù)這一結果，可以得出銀杏葉的葉片下面是真菌或昆蟲入侵的一個主要位置的結論。

MALDI-MSI除用于藥用有效成分分析之外，還被用于蛋白組學以及藥物在生命體中的代謝機制研究。植物的內源肽會影響細胞的分裂、發(fā)育、結瘤、繁殖、共生固氮體系以及防御反應，因此需要揭示其在分子水平上的作用。Gemperline等[49]通過對蒺藜苜蓿種數(shù)百種內源肽以及蛋白片段的成像，發(fā)現(xiàn)不同生長階段的內源肽總數(shù)和空間分布存在差異性，為進一步研究內源肽在藥用植物物生長中的功能提供了參考。Yang等[58]利用MALDI-MSI對瑪卡中提取得到的咪唑類生物堿在小鼠組織中的代謝機制及分布進行了分析，這種無標記的原位成像技術將有助于推進藥理作用機制的研究。

4總結與展望

MALDI-MS具有如高通量、高靈敏度、易于樣品制備和快速分析等優(yōu)點，與成像技術結合可實現(xiàn)原位分析，為藥物活性成分的空間分布情況提供了理論依據(jù)，也為進一步研究藥用植物中代謝物的生物合成途徑、儲存與運輸過程奠定了基礎。但研究過程中仍然存在不足之處：MALDI離子源對一些低豐度化合物的離子化效率不高;由于不同部位的組織結構不同，在制備植物樣品切片過程中需采用不同的切片技術，成像效果不易掌握;切片后基質的調和、涂布、干燥等流程耗時較長，基質涂布的均勻性等對MALDI技術在藥用植物分析應用中的推廣產生了一定的制約作用。隨著離子化效率和成像速率的提升，省時、省力、能大幅提高成像分辨率和重現(xiàn)性的樣品前處理方法的出現(xiàn)，該項技術在藥用植物的研究中將發(fā)揮越來越大的作用。

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