鄒婷婷 楊金易 徐振林 王弘 孫遠明 雷紅濤 譚學才 沈玉棟

摘 要：采用共有骨架結(jié)構(gòu)結(jié)合不飽和線性手臂半抗原策略，通過免疫新西蘭大白兔獲得了可同時識別他達拉非、氨基他達拉非和去甲基他達拉非的特異性多克隆抗體，通過優(yōu)化反應條件，建立了微孔側(cè)流免疫層析方法，用于保健酒及口服液樣品中非法添加的他達拉非類藥物殘留的快速檢測。本方法定量檢出限為0.05～0.30 ng/mL， 裸眼消線值在50～100 ng/mL之間，檢測時間小于10 min;與其它結(jié)構(gòu)功能類似物無明顯交叉反應，特異性良好。對保健酒及口服液樣品的添加回收率在78.7%～117.8%之間，相對標準偏差小于15%。本方法檢測結(jié)果與HPLCMS/MS法檢測結(jié)果一致，適用于保健酒及口服液中他達拉非類藥物的快速篩查。

關(guān)鍵詞：他達拉非; 微孔側(cè)流免疫層析; 保健酒及口服液; 半抗原; 多克隆抗體

1 引 言

他達拉非（Tadalafil）是一種5型磷酸二酯酶（Phosphodiesterase 5， PDE5）抑制劑，具有治療男性陰莖勃起功能障礙（Erectile dysfunction， ED）的作用[1]，作為處方藥已在多個國家上市。但他達拉非類藥物對人體的心血管、消化和神經(jīng)系統(tǒng)存在一定副作用，特別在不知情的情況下，與硝酸酯類藥物同時食用，會對食用者健康和生命造成嚴重威脅[2]。因此，2012年國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了“食藥監(jiān)辦?；躘2012＼]33號”文件，明確禁止在保健品中添加他達拉非、氨基他達拉非PDE5抑制劑。然而，利益的驅(qū)動導致壯陽抗疲勞類保健品中非法添加他達拉非類藥物現(xiàn)象仍屢有發(fā)生[3，4]，且為了規(guī)避執(zhí)法檢查，還推出了他達拉非結(jié)構(gòu)類似物—去甲基他達拉非[5]。因此，建立他達拉非類藥物多殘留檢測方法具有重要的實際意義。

目前，他達拉非類藥物非法添加的檢測方法主要為實驗室大型儀器確證技術(shù)，如高效液相色譜法[6，7]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[9]等。 但單一大型儀器確證技術(shù)難以對食品進行高效的監(jiān)測， 而基于抗原與抗體免疫識別的快速篩查方法作為與之互補的檢測技術(shù)，已成為食品安全高效檢測的不可或缺主流快速檢測手段。微孔側(cè)流免疫層析技術(shù)（Microwell lateral flow immunochromatography， mwLFIA）作為一種新型免疫層析技術(shù)，具有靈敏度高、操作簡便、耗時短的優(yōu)點。該方法是對傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)的改進，其原理是：先使游離的待測物和標記抗體在微孔中均相溶解后充分反應，然后再通過層析至固相載體上的包被抗原進行快速捕獲金標抗體而聚集顯色，微孔中游離待測物和金標抗體反應越充分，游離的金標抗體越少，固相載體上包被原捕獲的金標復合物越少，顯色就越淺，檢測靈敏度越高。該技術(shù)作為儀器確證法的快速篩查互補方法，引起研究者的廣泛關(guān)注?；谠撛?，研究者已經(jīng)建立了牛奶基質(zhì)中喹諾酮類藥物和苯并咪唑類化合物的多殘留微孔側(cè)流免疫層析檢測技術(shù)[10，11]，檢出限分別為0.1 和0.77 ng/mL，靈敏度高，適用于實際樣品的檢測。然而，目前同時檢測他達拉非類藥物的mwLFIA方法還未見報道。

本研究采用共有骨架結(jié)構(gòu)結(jié)合不飽和線性手臂半抗原策略[12]（圖1），最大限度保留他達拉非骨架結(jié)構(gòu)，通過免疫新西蘭大白兔，制備可同時識別他達拉非、氨基他達拉非和去甲基他達拉的非特異性多克隆抗體，并基于微孔側(cè)流免疫層析技術(shù)，建立了可檢測他達拉非類藥物的側(cè)流免疫分析方法，為食品安全監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

2 實驗方法

2.1 儀器與試劑

U3010紫外可見光譜儀（日本 Hitachi 公司）; HM3030 XYZ三維劃膜噴金儀和CTD300數(shù)控裁條機（上海金標生物科技有限公司）; MD100金標熒光二合一免疫檢測儀（南京微測生物科技有限公司）; AB SCIEX 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）; 5417R高速離心機（德國 Eppendorf 公司）; NEVAP氮吹儀（德祥科技有限公司）。

半抗原H1、H2、20 nm金納米粒子（Au nanoparticles， AuNPs）溶液（本實驗室自制）; 馬來酸酐、他達拉非、氨基他達拉非、去甲基他達拉非及西地那非類藥物（上海阿拉丁試劑有限公司）; 羊抗兔IgG抗體、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、鑰孔血藍蛋白（KLH）（美國Sigma公司）; 硝酸纖維素膜、DB6吸水紙（上海杰一生物科技有限公司）; H8底板（基因有限公司）; 玻璃纖維膜（美國Ahlstrom公司）; 樣品墊處理液和金標復溶液（廣州萬聯(lián)生物科技有限公司）; 其它試劑購自廣州化學試劑公司。保健酒和口服液購自廣州市某藥店。

實驗中所用的溶液：0.1 mol/L K2CO3溶液（13.8 g/L），10% BSA（10 g/L BSA），包被液（pH 9.6，0.1 mol/L 碳酸鹽緩沖液），0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PB，3.117 g/L KH2PO4， 20.742 g/L Na2HPO4·12H2O）， 0.1 mol/L KOH溶液（5.6 g/L）。

2.2 實驗方法

2.2.1 半抗原的合成和鑒定 按照文獻＼[13＼]方法制備半抗原H1。半抗原H2的制備方法如下： 在25 mL兩口圓底燒瓶中，將117.12 mg氨基他達拉非溶于5 mL甲醇，逐滴加入溶有37.02 mg乙醛酸的甲醇（3 mL），60℃回流反應3 h后停止加熱，常溫下繼續(xù)攪拌至白色固體析出，真空抽濾，用2 mL甲醇洗滌濾餅2次，濾渣烘干，即得白色固體狀半抗原H2，經(jīng)ESIMS質(zhì)譜鑒定合成成功（ESIMS：m/z 445.63 ＼[M＼]）。

2.2.2 人工抗原的合成與鑒定 采用活潑酯法[14，15]將半抗原H1與BSA偶聯(lián)作為免疫原（H1BSA），將H1和H2分別與載體蛋白OVA、KLH偶聯(lián)得到包被原（H1OVA、H1KLH、H2OVA、H2KLH），采用紫外掃描法并結(jié)合免疫血清的效價與抑制實驗進行鑒定[14，15]，分裝于離心管中，20℃凍存。

2.2.3 抗體的制備與純化 參照文獻＼[16＼]，采用免疫原H1BSA免疫3只2.0～2.5 kg雌性新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。通過酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）測定抗血清效價與抑制率，進行抗體性能鑒定。采用辛酸硫酸銨沉淀法[17]純化抗體，于20℃凍存。

2.2.4 包被原/抗體組合的篩選

分別以H1OVA、H1KLH、H2OVA、H2KLH為包被原，采用間接競爭ELISA方法，考察抗體/包被原組合效價和抑制，并結(jié)合試紙條質(zhì)控線（Control line， C line）與檢測線（Test line， T line）顯色情況確定最優(yōu)抗體/包被原組合，進行mwLFIA方法優(yōu)化。

2.2.5 AuNPs溶液pH值優(yōu)化 采用文獻＼[18＼]的方法制備和鑒定AuNPs溶液。在4個裝有1 mL AuNPs溶液的離心管中，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值分別為8.0、8.5、9.0和9.5，各加入適量抗體進行標記，振蕩10 min，再加入20 μL 10% BSA，振蕩20 min，4℃ 12000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀加入等體積溶液振蕩復溶，裸眼觀察復溶情況，測定各復溶液在525 nm處的吸光值，將易復溶、吸光值最高的復溶液的pH值作為最佳標記pH值。

2.2.6 標記抗體濃度優(yōu)化 在已確定pH值的AuNPs溶液中加入適量抗體（8.0 mg/mL），終濃度分別為4.0、8.0 、12.0、16.0、20.0和24.0 μg/mL，振蕩孵育10 min后，加入20 μL 10% BSA溶液，繼續(xù)振蕩20 min，離心后棄上清液，等體積振蕩復溶， 測定525 nm吸光值，選擇維持AuNPs溶液為紅色的最低抗體濃度為最佳抗體標記濃度[19]。

2.2.7 金標抗體用量和包被原濃度的選擇

分別吸取2.2.6節(jié)制備的金標抗體溶液3、6和9 μL于微孔板中，37℃烘干; 將包被原分別以2.0和4.0 mg/mL劃膜于試紙條，烘干后，通過棋盤法檢測陰性緩沖液（0.1 mol/L PB溶液）和50 ng/mL他達拉非陽性標準液，用免疫層析讀數(shù)儀測定，選擇陰性孔試紙條T/C≈1.0，T、C線顯色明顯，且陽性抑制率高的作為最佳金標抗體量/包被原濃度組合。

2.2.8 試紙條的組裝和金標微孔的制備

試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水紙和PVC底板四部分組成，NC膜上T線為包被原，C線為羊抗兔IgG抗體，將樣品墊、NC膜和吸水紙依次銜接粘貼在PVC底板上，切成3.05 mm寬試紙條（圖2），密封干燥保存。吸取按2.2.7節(jié)確定的金標抗體量鋪于96孔板的微孔，振蕩均勻，37℃烘干過夜，密封干燥保存。

2.2.9 測定步驟及結(jié)果判定 吸取80 μL緩沖液于金標微孔內(nèi)，室溫孵育5 min后，將試紙條垂直插入微孔，反應6 min。裸眼觀察判斷： T線和C線顯色相近時，結(jié)果判定為陰性; T線顏色淺于C線時，結(jié)果判定為弱陽性; T線無色結(jié)果判定為強陽性; C線無色，試紙條判定為失效（圖2）。同時，采用免疫層析讀數(shù)儀讀數(shù)， 建立標準曲線， 并確定樣本中他達拉非及其類似物含量。

2.2.10 樣品前處理 準確量取0.5 mL保健酒或口服液樣品于10 mL離心管，加入2 mL KOH溶液（0.1 mol/L）后， 用2 mL CHCl3振蕩萃取40 s，靜置分層后， 取下清液于10 mL離心管，重復萃取2次，合并下清液，50℃氮吹至干，用50 μL 0.1%乙酸甲醇溶液復溶后，加0.1 mol/L PB稀釋至0.5 mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNPs制備與鑒定

通過紫外掃描（圖3A）可知，該AuNPs溶液的最大吸收波長為525 nm， 最大吸收峰的峰寬較窄，說明制備的AuNPs顆粒均勻，通過透射電鏡（圖3B）對其進行掃描，計算100個粒子， 得AuNPs的平均粒徑為20 nm。通過裸眼觀察（圖3B插圖）， 制備的AuNPs色澤鮮艷，澄清透明。

3.2 人工抗原的合成與鑒定

以半抗原及載體蛋白為參照對人工抗原進行紫外光譜掃描（圖4），發(fā)現(xiàn)人工抗原的吸收光譜與半抗原和載體蛋白均有所不同，特征吸收峰位移或峰型發(fā)生一定變化，說明半抗原共價偶聯(lián)至載體蛋白表面。

后續(xù)抗血清競爭抑制實驗顯示針對藥物和半抗原顯現(xiàn)出特異性識別反應（表1），說明產(chǎn)生了特異性抗體，從而證明人工抗原合成成功。

3.3 包被原的篩選

采用間接競爭ELISA方法，以他達拉非（1 μg/mL）為競爭物，以同源和異源包被的方式測定純化后抗體的效價和抑制率，結(jié)果見表1，對于所有包被原，抗體H1BSA均顯示出較好的親和力和識別效果。進一步將包被原以1 mg/mL的濃度通過劃膜包被于NC膜的檢測線上。

3.4 金標抗體pH值與抗體濃度的確定

在不同pH值的標記條件下制備金標抗體（圖6A），發(fā)現(xiàn)隨著AuNPs溶液pH值增大，其吸光值先變大后變小，當pH=9.0時，吸光值最大，此時AuNPs溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選擇制備金標抗體的最佳pH=9.0。同時，在不同抗體濃度下制備金標抗體（圖6B），發(fā)現(xiàn)當抗體濃度為16.0 μg/mL時，AuNPs溶液顏色和525 nm處的吸光值開始趨向平緩，因此制備金標抗體時選擇抗體濃度為16.0 μg/mL。

3.5 金標抗體用量和包被原濃度的確定

采用棋盤法確定最佳抗體和包被原濃度，結(jié)果表明，金標抗體（16.0 μg/mL）用量為9 μL、包被原濃度為4 mg/mL時，陰性T/C=1.0，T、C線顯色最明顯，陽性試紙條抑制率高達90.0%。因此，選擇金標抗體用量為9 μL、包被原4 mg/mL組合。

3.6 標準曲線的建立

取經(jīng)HPLCMS/MS確證為陰性的保健酒或口服液樣品，按照2.2.10節(jié)方法制備陰性樣品溶液，將1.0 mg/mL他達拉非類藥物溶液稀釋，分別配制成100、50 、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0 ng/mL他達拉非類藥物標準溶液，在最優(yōu)條件下進行mwLFIA實驗，用讀數(shù)儀讀取不同標準品濃度下試紙條T/C值，以B/B0為縱坐標（其中，B0為不加藥物時的T/C值，B為藥物濃度為x時的T/C值），標準品濃度為橫坐標，利用Origin 8.5擬合繪制標準曲線，確定檢出限LOD（IC20，B/B0=0.2時所對應的藥物濃度）、半抑制濃度（IC50，B/B0=0.5時所對應的藥物濃度）及裸眼消線值（T線變開始變?yōu)闊o色對應的藥物濃度，即Cutoff值）。結(jié)果表明，他達拉非類藥物的LOD為0.05～0.30 ng/mL，IC50為0.64～3.41 ng/mL，裸眼消線值在50 ～100 ng/mL之間（圖7和表2）。目前，檢測他達拉非類藥物含量多采用儀器方法（表3），本方法不僅可達到相同水平的檢出限，并且具有成本低、操作簡便、快速等優(yōu)勢，具有良好的實際應用價值。

3.7 方法的特異性和穩(wěn)定性

按公式（1）計算交叉反應率（Crossreactivity， CR），評價抗體特異性。

為他達拉非結(jié)構(gòu)功能類似物的IC50。將他達拉非及其類似物配制成200 ng/mL溶液，進行mwLFIA測定，與PB緩沖液對照（圖8和表4）。結(jié)果表明，本方法可對他達拉非、氨基他達拉非和去甲基他達拉非特異性識別，而與其它結(jié)構(gòu)功能類似物無明顯交叉反應，說明此抗體針對他達拉非、氨基他達拉非以及去甲基他達拉非的特異性良好。

將試紙條和金標微孔放入鋁箔袋中，37℃干燥保存，分別于第1、3、5、7天取出，采用本方法進行檢查，幾次檢測結(jié)果相近，C、T線的顏色變化不大，靈敏度不變，表明本方法穩(wěn)定性良好。

3.8 實際樣品分析

向陰性保健酒和口服液樣品中添加他達那非類藥物標準品，使終濃度為10、20和50 ng/mL，按照2.2.10節(jié)進行樣品前處理后，分別采用mwLFIA和HPLCMS/MS方法[24]測定。結(jié)果（表5）表明，mwLFIA方法的平均回收率為78.7%～117.8%，RSD <15%，與HPLCMS/MS方法檢測結(jié)果一致，說明本研究建立的免疫層析檢測方法準確可靠，可用于實際樣品檢測。

4 結(jié) 論

本研究建立了保健酒和口服液樣品中他達拉非、氨基他達拉非和去甲基他達拉非同時檢測的mwLFIA方法，檢出限為0.05～0.30 ng/mL，裸眼消線值在50～100 ng/mL之間，樣品添加回收率為78.7%～117.8%，與HPLCMS/MS法檢測結(jié)果一致。本方法靈敏、快速、穩(wěn)定性好，適用于保健酒和口服液基質(zhì)中他達拉非類藥物的現(xiàn)場快速篩查。

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