林俊杰 周光宏 何 俊 孫楊贏 潘道東 李 剛 曹錦軒，*

(1 寧波大學食品與藥學學院/動物蛋白深加工重點實驗室，浙江 寧波 315211；2 南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210097；3 浙江華統(tǒng)肉制品股份有限公司，浙江 義烏 322005)

食品包裝中廣泛使用的塑料膜因其不易分解和不可再生帶來的環(huán)境污染和食品安全問題逐漸受到人們的重視，因此急需開發(fā)無毒、可降解、可再生的材料來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的塑料包裝材料，其中以天然高分子為原料來制備可食性膜已成為近年來國內外研究的熱點。根據使用的基質不同，可食膜可以分為多糖膜、蛋白膜、脂質膜和復合型膜，其中蛋白質所形成的可食性蛋白膜具有一定的機械特性和較好的阻氣性，可以防止脂肪氧化和揮發(fā)性成分揮發(fā)[1]，用于食品包裝可以保持食品質量和延長食品的貨架期[2]，因此蛋白質被認為是最具潛力的可食性膜材料。

明膠是膠原蛋白通過酸法、堿法、酶法、鹽堿法或者在加熱條件下所得到的變性產物[3]，其來源廣泛、價格低廉、無毒，而且具有良好的成膜性和生物兼容性，是一種很好的天然可食性膜材料[4-5]。明膠與膠原蛋白具有相似的氨基酸組成，主要包含甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和4-羥基脯氨酸，其中Gly-X-Y、Gly-X-Hyp、Gly-Pro-Y的周期性序列對于膠原蛋白三維結構的形成和穩(wěn)定極為重要[6-7]。在形成明膠的過程中，這種三維螺旋結構被破壞，但是在明膠成膜的過程中，明膠又會逐步向膠原蛋白三維螺旋結構復性，從而使得明膠膜具有很好的機械性能；另一方面，明膠分子間較強作用力(氫鍵和疏水作用)的存在，使得明膠膜具有很大的脆性，限制了它的廣泛應用[8]。

增塑劑作為一類非揮發(fā)性的小分子化合物，一般是平均分子質量為300～600的高沸點液體，被廣泛用于改善膜的柔韌性和可加工性[9]。增塑劑可以滲入到高分子鏈之間，減少分子移動所需要的能量，并且阻止分子鏈間氫鍵的形成，導致分子間的自由體積和移動性增加，從而起到增塑的效果[10]。因此，增塑劑對膜的增塑效果與其理化性質密切相關，包括大小、形狀、化學結構、極性和溶解度等[11-12]。此外，增塑劑還被分為外增塑劑和內增塑劑，外增塑劑是指一些易揮發(fā)物質，能與聚合物反應，但不能與聚合物分子形成共價鍵，在蒸發(fā)、遷移或者提取的過程中易失去；內增塑劑一般具有很大的結構，它是從聚合物自身衍化而來，能夠異物共聚到聚合物分子結構中或者與聚合物反應[10]。

近年來，用于明膠膜的增塑劑主要有多元醇(甘油和山梨三醇)、低聚糖(蔗糖)、有機酸(脂肪酸、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸等)和不同分子質量的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)[10]。Cao等[13]研究蔗糖、油酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、不同分子質量的PEG(300、400、600、800、1 500、4 000、10 000、20 000)、山梨三醇、甘露醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺對明膠膜機械性能的影響，發(fā)現(xiàn)低分子質量的PEG(300)、蘋果酸、山梨三醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺對明膠膜具有很好的增塑效果。Orts等[14]發(fā)現(xiàn)氨基酸對淀粉膜有一定的增塑作用，增塑效果取決于氨基酸的種類。氨基酸作為蛋白質的基本組成單位，添加氨基酸是否對明膠膜具有增塑效果，對明膠膜的性能和結構是否有影響尚不清楚。因此，研究不同氨基酸對明膠膜物理機械性質的影響具有一定的意義。本研究以明膠為原料，甘油為共同增塑劑，根據氨基酸的大小、結構、極性、溶解性等性質的差異，選擇脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸為添加劑，研究上述氨基酸對明膠膜物理機械性能及結構的影響，旨在發(fā)現(xiàn)用于明膠膜的新增塑劑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

明膠(Type B)、甘油、亮氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酸、精氨酸，國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

FA-1004萬分之一電子天平，上海精天電子儀器有限公司；8002溫控水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器廠；99-1磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；MGC-350HPY-2恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；UltraScan-PRO測色儀，美國亨特立公司；UV1800PC紫外-可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本基恩斯國際貿易有限公司；NEXUS-670傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；Instron-5569A電子萬能材料試驗機，美國英斯特朗公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 明膠膜制作 將6 g明膠溶解于100 mL去離子水中，60℃恒溫水浴鍋中加熱并攪拌30 min，然后加入25%(w/w，甘油/明膠)的甘油作為增塑劑，室溫下磁力攪拌30 min后分別加入1 g亮氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和谷氨酸，磁力攪拌30 min溶解混合均勻；將成膜液在4 000 r·min-1條件下離心5 min脫除氣泡；取10 mL成膜液傾倒入9 cm的塑料培養(yǎng)皿中，放入25℃、相對濕度55%±5%的恒溫恒濕箱中干燥48 h，取出揭膜。保存于25℃、相對濕度50%的恒溫恒濕箱中待測。

1.3.2 表觀特征 通過電子顯微鏡在4×10放大倍數下觀察明膠膜的表觀特征。

1.3.3 厚度測定 用千分測厚規(guī)在膜上隨機選取10個點，測定其厚度并計算平均值，單位mm。

1.3.4 機械特性測定 按照GB/T 1040.3-2006[15]中塑料拉伸性能試驗方法進行測定。將膜剪切成50 mm×20 mm的矩形長條，利用電子萬能材料試驗機進行測試，試樣有效長度為30 mm，拉伸力為100 N，拉伸速度為30 mm·min-1，每組10個重復。

1.3.5 水蒸氣透過率測定 將4 mL去離子水注入5 mL燒杯中，分別用膜將杯口包覆并用透明膠固定(相對濕度100%)，然后置于含有無水硅膠(相對濕度0%)的干燥器中，8 h內每1 h用分析天平稱重一次。按照公式計算水蒸汽透過率(water vapor permeability，WVP)[16]：

WVP (g·m-1·s-1·Pa-1)=W × L × A-1× t-1× (P2- P1)-1

(1)

式中，W為燒杯質量的變化，g；L為膜的厚度，m；A為膜的表面積，m2；t為燒杯發(fā)生質量變化的時間，s；P2-P1為膜兩側水蒸氣分壓差，kPa，由于膜兩側環(huán)境濕度梯度為100%，P2-P1=3.179 kPa(22℃)。

1.3.6 顏色測定 采用測色儀測定膜的顏色性質，以L*(黑-白)、a*(紅-綠)、b*(黃-藍)和總色差△E*來表示。按照公式計算△E*:

ΔE*=[(ΔL*)2+ (Δa*)2+ (Δb*)2]1/2

(2)

式中，△L*、△a*和△b*為白板參數與測量數值差值；白板參數為L*=93.59、a*=0.98、b*=0.35。

1.3.7 透光率測定 裁剪樣品尺寸為10 mm×50 mm，將膜樣品貼在比色皿外側，用紫外分光光度計在200～800 nm波長下測定膜的透光率。以空氣作為空白對照。選取600 nm波長下的吸光度，并按照公式計算透明度(transparency，T)：

T=(-log T600)/x

(3)

式中，T600為600 nm處膜的吸光度；x為膜厚度，mm。

1.3.8 紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)測定 將冷凍干燥后的膜置于全反射托盤上，用傅里葉變換紅外光譜儀在室溫下進行紅外掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數為32，分辨率為4 cm-1，掃描間隔為2 cm-1。

1.3.9 二級結構計算 采用PeakFit 4.12軟件對波數在1 600～1 700 cm-1范圍內的圖譜進行基線校正、去卷積和二階導數擬合，直至殘差(R2)大于0.999，得到子峰圖譜，然后根據各子峰峰位和峰面積計算對應二級結構(β-折疊、無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-轉角)的含量。

1.4 數據分析

采用SPSS 13.0中One-Way-ANOVA進行差異性檢驗，并用DUCAN法進行Post Hoc檢驗。結果以平均數±標準差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同氨基酸對明膠膜厚度的影響

由表1可知，明膠膜的厚度在0.074～0.176 mm范圍內，添加亮氨酸和谷氨酸顯著增加了明膠膜的厚度(P< 0.05)。膜的厚度主要取決于膜液中的固體含量[17]，添加亮氨酸和谷氨酸導致膜厚度增加可能與它們在水中較低的溶解性有關，當膜被干燥時，固體析出，導致膜表面厚度增加。

2.2 不同氨基酸對明膠膜機械性能的影響

由表1可知，對照組明膠膜抗拉伸強度(tensile strength， TS)和斷裂伸長率(elongation at break，EAB)分別為14.76 MPa和16.95%，添加脯氨酸和絲氨酸顯著降低了明膠膜的TS(P< 0.05)，并伴隨著EAB的顯著增加(P< 0.05)；亮氨酸明膠膜的TS和EAB分別為57.57 MPa和28.18%，較對照分別增加了2.90倍和0.66倍；添加谷氨酸使明膠膜的TS從14.76 MPa降至3.38 MPa(P< 0.05)，但對EAB的影響不顯著；添加甲硫氨酸對明膠膜的機械性能無顯著影響。綜上表明，脯氨酸和絲氨酸對明膠膜具有一定的增塑效果，而亮氨酸對明膠膜具有一定的增強效果。

2.3 不同氨基酸對明膠膜水蒸氣透過率的影響

由表1可知，對照組明膠膜水蒸氣透過率(WVP)為1.18 g·m-1·s-1·Pa-1，添加脯氨酸和絲氨酸后，明膠膜的WVP有一定的升高，但不顯著(P> 0.05)，而添加亮氨酸和谷氨酸后，明膠膜的WVP顯著升高(P< 0.05)。

表1 添加氨基酸對明膠膜厚度、機械性能及水蒸氣透過率的影響Table 1 Effect of adding amino acids on thickness, mechanical properties and WVP of gelatin film

注：同列不同小寫字母表示各組別間差異顯著(P< 0.05)。下同。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

2.4 不同氨基酸對明膠膜顏色的影響

色澤是衡量消費者對食品包裝滿意度的一個重要指標。由表2可知，氨基酸的類型對明膠膜的顏色具有顯著影響，添加脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸均顯著降低了膜的L*值和a*值(P< 0.05)，并伴隨著b*值和ΔE*值的增加；除添加脯氨酸外，添加其他氨基酸均顯著增加了b*值和ΔE*值(P< 0.05)。結果表明，添加氨基酸可以增加明膠膜的黃度。

2.5 不同氨基酸對明膠膜透光率的影響

薄膜的光學性質是影響其外觀、適銷性和應用的重要屬性。清晰的可食用薄膜通常在食品包裝系統(tǒng)中具有更高的適用性和可接受性。由表3可知，在紫外光200 nm下，所有的明膠膜均呈現(xiàn)較低的透光率，透光率在0.33%～0.61%范圍內。在可見光350～800 nm范圍內，對照組明膠膜的透光率在71.63%～90.49%范圍內，添加甲硫氨酸、谷氨酸、絲氨酸和亮氨酸明顯降低了明膠膜透光率，而添加脯氨酸后呈現(xiàn)增加趨勢，尤其在500～800 nm波長范圍內。

表2 添加不同氨基酸對明膠膜顏色的影響Table 2 Effect of adding different amino acids on the color of gelatin film color

膜的透明度對其外觀以及應用等有重要影響，透明度值越高，表明膜的透明度越低。由表3可知，添加脯氨酸降低了明膠膜的透明度值，而添加亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸顯著增加了明膠膜的透明度值，降低了明膠膜的透明度。

表3 不同氨基酸明膠膜的透光度和透明度Table 3 Light transmission and transparency of gelatin films containing different amino acids

2.6 不同氨基酸對明膠膜表面形貌的影響

添加不同氨基酸的明膠膜在熒光顯微鏡下的表面形貌如圖1所示。對照組和添加脯氨酸的明膠膜展現(xiàn)出光滑透明的膜表面，而添加亮氨酸和谷氨酸的膜表面粗糙，且具有許多黑洞，這主要是由于在成膜的過程中，有顆粒析出膜表面，當光通過膜表面時被反射，從而形成較多黑洞；而粗糙的膜表面可能是因為這些氨基酸在膜中分散不均勻，這可能也是添加亮氨酸和谷氨酸的明膠膜相對于對照組具有更高的水蒸氣的透過率和更低透光率的原因。此外，添加絲氨酸和甲硫氨酸的明膠膜表面形成了許多花紋，從而阻礙了光的透過。不同膜表面形貌可能與氨基酸的溶解度有關，不易溶于水的亮氨酸和谷氨酸在膜干燥的過程中析出表面，極易溶于水的脯氨酸形成了均勻、光滑、透明的薄膜，而絲氨酸和甲硫氨酸處于兩者之間。

圖1 添加不同氨基酸明膠膜的表觀特征Fig.1 Apparent characteristics of gelatin films with different amino acids added

2.7 不同氨基酸對明膠膜紅外譜圖的影響

由圖2可知，明膠膜的酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ帶對應的波數分別出現(xiàn)在3 285.27、3 075.78、1 628.5、1 542.95和1 235.59 cm-1，其中酰胺A代表N-H伸縮振動通過氫鍵與OH基團結合[18]；酰胺B代表=C-H和-NH3的不對稱伸縮振動[18]；酰胺-Ⅰ振動模式主要與CN拉伸，CCN變形和平面NH彎曲模式耦合的C=O伸縮振動有關[5]；酰胺Ⅱ代表N-H基團的彎曲振動和C-N基團的伸縮振動[5]；酰胺Ⅲ代表C-N和N-H鍵的平面振動或甘氨酸CH2基團的振動[19]。波數1 031～1 033 cm-1處代表甘油中的羥基峰[19]。

由圖2可知，對照組、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸明膠膜對應的酰胺Ⅰ帶波數分別出現(xiàn)在1 628.50、1 626.89、1 628.21、1 628.09、1 626.52 和1 626.36 cm-1；對照組、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸明膠膜對應的酰胺A帶波數分別出現(xiàn)在3 285.27、3 284.91、3 284.15、3 284.48、3 280.85和3 282.25 cm-1。與對照組(3 074.36 cm-1)相比，添加脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸的酰胺B帶波數分別出現(xiàn)在 3 072.78、3 074.34、3 073.76、3 071.57 和3 071.99 cm-1。結果表明，添加脯氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸酰胺A，酰胺B和酰胺Ⅰ向低波數偏移，而亮氨酸和谷氨酸對明膠紅外譜圖無明顯影響。

圖2 添加不同氨基酸明膠膜紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of gelatin films containing different amino acids

2.8 不同氨基酸對明膠膜二級結構的影響

由于酰胺Ⅰ(1 700～1 600 cm-1)的構象敏感，所以常被用來確定蛋白質的二級結構[20]。選取波數在1 651 ～1 660 cm-1范圍為α-螺旋結構，在1 600 ～1 639 cm-1范圍為β-折疊結構，1 661 ～1 700 cm-1范圍為β-轉角結構，1 640 ～1 650 cm-1范圍為無規(guī)卷曲結構[21]。由圖3可知，明膠膜主要由β-折疊結構構成。添加氨基酸后，無規(guī)則卷曲結構含量減少，α-螺旋結構含量無明顯變化，添加脯氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸后β-折疊和β-轉角結構含量增加，添加谷氨酸和亮氨酸對明膠二級結構影響不明顯。

圖3 添加不同氨基酸對明膠膜二級結構的影響Fig.3 Effects of adding different amino acids on the secondary structure of gelatin films

3 討論

增塑劑對膜的增塑效果取決于增塑劑的理化性質(大小、形狀、化學構成、分子質量和功能基團)和其與聚合物的兼容性(極性、氫鍵、介電常數和溶解度)[13]。本研究結果表明，添加脯氨酸和絲氨酸增加了明膠膜的斷裂伸長率，并伴隨著拉伸強度的降低，這可能是因為氨基酸中的極性基團能夠破壞明膠分子產生的氫鍵，從而削弱明膠分子間的作用力，導致分子間的自由體積增大，使明膠分子更易移動，因而膜材料柔性增加，拉伸強度下降[22]。本研究還發(fā)現(xiàn)，添加亮氨酸和谷氨酸時，膜表面有固體顆粒析出，但是亮氨酸膜質地較硬較脆，而谷氨酸膜相對較軟，因而亮氨酸增加了明膠膜的拉伸強度，而谷氨酸降低了膜的拉伸強度，這可能與氨基酸的性質有關。添加亮氨酸可同時增加明膠膜的拉伸強度和斷裂伸長率，這與Wu等[23]報道添加5%羥基磷灰石對明膠膜機械性能影響的結果一致。

為延長食品保質期，一般要求保鮮膜具有較低的水蒸氣透過率[24]。本研究結果表明，添加脯氨酸和絲氨酸增加了明膠膜的水蒸氣透過率，可能是因為這2種氨基酸對明膠膜具有一定的增塑效果，增加了明膠鏈間的自由體積，加快了水的擴散。此外，添加亮氨酸和谷氨酸時，明膠膜水蒸氣透過率較對照組分別提升了1.14和1.12倍，這可能與氨基酸的溶解度有關。不溶于水的增塑劑在膜干燥過程中容易析出，形成不連續(xù)區(qū)，導致水蒸氣透過率增加[25]。

膜的色澤和光學性質是消費者評定膜食品包裝的兩個重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，添加氨基酸增加了明膠膜的黃度值(b*值)，這與Nuanmano等[26]研究明膠水解物對肌原纖維蛋白膜顏色影響的結果相似，這主要是因為膜干燥過程中-NH3與C=O發(fā)生了美拉德反應，添加氨基酸增加膜液中游離氨基含量，在膜干燥過程中的美拉德反應更明顯。此外，本研究結果還表明，在200 nm紫外光下，明膠膜都具有很低的透光率，這與Ahmad等[27]報道的魚皮明膠/米粉復合膜透光率結果一致，主要是因為明膠中含有大量的芳香氨基酸能吸收紫外光。本研究還發(fā)現(xiàn)，添加脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸均會降低明膠膜紫外光透過率，尤其是添加甲硫氨酸，表明在紫外光范圍內，添加甲硫氨酸更有助于降低光透過率。在350～800 nm可見光范圍內，膜的透光率主要取決于固體顆粒在膜中的分散程度[28]。亮氨酸和谷氨酸在膜干燥過程中有固體物質析出，具有反射光的作用，從而阻礙了可見光的透過，降低了明膠膜的透光率；而甲硫氨酸和絲氨酸降低膜的可見光透光率主要是因為在膜的表面形成了花紋。

紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶向低波數偏移表明氨基酸中的活性基團能與明膠反應，減弱明膠膜鏈間的作用力[27]；酰胺A帶向低波數移動表明氨基酸明膠分子反應是通過氫鍵作用的[29]；酰胺B帶向低波數移動表明明膠官能團的構象發(fā)生了變化[28]，這可能與明膠二級結構變化有關。蛋白質二級結構的穩(wěn)定性大部分依靠非共價鍵力，如氫鍵、范德華力、靜電相互作用和疏水相互作用。本研究中，明膠二級結構以β折疊為主，這與史洲銘等[30]的研究結果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，添加脯氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸使得無規(guī)則卷曲轉向β-折疊，這可能是因為脯氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸與明膠反應形成了氫鍵，使得較高波數的無規(guī)卷曲向低波數的β-折疊轉變[21]，這與紅外光譜中酰胺Ⅰ帶的變化結果一致。鄭雅爻等[31]研究鰱魚皮明膠提取方法對明膠膜性能的影響，發(fā)現(xiàn)明膠膜的機械強度與明膠的α-螺旋結構含量存在顯著正相關，與其他二級結構不存在顯著相關性，這也解釋了氨基酸的添加使明膠中的無規(guī)則卷曲結構減少，未增加明膠膜機械強度，反而導致斷裂伸長率的增加，因此不同氨基酸影響明膠膜機械性能的機制不同，仍有待進一步深入研究。

4 結論

明膠膜的厚度、機械性能、顏色、水蒸氣透過率、透光率等性能的變化取決于添加的氨基酸種類。本研究所用的5種氨基酸，除了甲硫氨酸外，脯氨酸、亮氨酸、絲氨酸和谷氨酸都可以作為明膠膜的天然增塑劑，增加明膠膜柔韌性；添加脯氨酸的明膠膜的柔韌性最好，具有更好的表觀特征，表面光滑緊致，同時具有更高的透明度、透光率和相對較低的水蒸氣透過率。綜上所述，脯氨酸最適合作為明膠膜的天然增塑劑。