賴偉寧， 康建紅， 于豐， 胡明月， 閆守慶， 祝萬菊

(1.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，長春130062； 2. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春130062)

動物毛色往往是一個物種或品種的重要特征，可作為形態(tài)學(xué)標(biāo)記來進(jìn)行物種或品種純度的鑒別(Drumletal.，2018；趙珊珊等，2018)，同時，毛色的差異也會對動物的生長速度、生產(chǎn)性能以及對疾病的抵抗力具有一定的影響，因此研究動物毛色多樣性的形成與調(diào)控機(jī)制具有重要理論和實踐意義。動物的毛色是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的色素決定，根據(jù)色素的性質(zhì)可分為真黑素和褐黑素，黑色素的種類和含量不同，毛發(fā)顏色有所不同(Fontanesietal.，2011)。

豚鼠Caviaporcellus屬于豚鼠科Caviidae，特殊的解剖結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特征使其被廣泛用于醫(yī)學(xué)動物實驗(劉迪文等，2017)；由于可愛的外表及溫順的脾氣，也被作為寵物廣泛飼養(yǎng)(Yuetal.，2018a)。豚鼠毛色具有豐富的多樣性(Yuetal.，2018b)，早期測交試驗表明，豚鼠毛色主要由7個基因座位的一系列等位基因控制，同一座位的不同等位基因或不同座位的等位基因相互作用可產(chǎn)生多種毛色類型(Wright，1927)。野生型豚鼠毛發(fā)除腹部白色外，其他部位呈鼠灰色，黃毛色豚鼠身體各部位均為黃色(圖1)。已有研究表明，豚鼠黃毛色呈孟德爾常染色體隱性遺傳模式，由extension基因座位的e等位基因控制(Ibsen，1919)。extension基因座位編碼黑素皮質(zhì)激素受體1(melanocortin receptor 1，MC1R)，該蛋白有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，是最小的G蛋白偶聯(lián)受體(García-Borrónetal.，2005)。MC1R與黑色素細(xì)胞刺激激素α結(jié)合，通過激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，然后通過環(huán)磷酸腺苷激活酪氨酸激酶催化黑色素細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸合成黑色素(楊永升等，2004)。由于MC1R在動物毛色形成與調(diào)控中扮演著重要的角色，其編碼基因的多態(tài)性與動物毛色的相關(guān)性已在多個物種中被廣泛研究，現(xiàn)已表明小鼠Musmusculus(Robbinsetal.，1993)、牛Bostarurs(Klunglandetal.，1995)、馬Equnscaballus(Marklundetal.，1996)、野豬Susscrofa(Kijasetal.，1998)、犬Canislupusfamiliaris(Evertsetal.，2000)和兔Oryctolaguscuniculus(Fontanesietal.，2006)的隱性黃毛色均與MC1R基因的多態(tài)性有關(guān)。本實驗選擇MC1R基因為豚鼠隱性黃毛色突變的候選基因，采用PCR擴(kuò)增和測序方法分析了MC1R基因多態(tài)性與豚鼠隱性黃毛色的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

實驗豚鼠來自吉林省長春市農(nóng)安縣相龍養(yǎng)殖場，分別采集60只野生型和33只黃毛色豚鼠背部毛發(fā)20～30根，存放于樣品袋中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?只野生型雌性和1只黃毛色雄性豚鼠用于測交實驗。豚鼠測交實驗在吉林大學(xué)實驗動物中心完成[實驗動物許可證號：SYXK(吉)2015-0006]。實驗方案經(jīng)吉林大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)通過。

圖1 野生型(左)和黃毛色(右)豚鼠的毛色表型Fig. 1 Phenotype of wild-type (left) and yellow-coatedcolor (right) Cavia porcellus

1.2 主要試劑

微量DNA提取試劑盒(EasyPure Micro Genomic DNA Kit)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×Taq PCR Mastermix、DL2000 DNA Marker和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成利用小鼠MC1R基因全長編碼區(qū)序列(NM_008559.2)在豚鼠參考基因組中進(jìn)行Blast檢索(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，獲得豚鼠MC1R基因的位置和編碼序列(NT_176187.1)，然后采用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物的名稱、位置以及核苷酸序列的詳細(xì)信息見表1和圖2，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增與測序選取野生型和黃毛色豚鼠各2只用于MC1R基因多態(tài)性的鑒定。毛囊DNA的提取采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的微量DNA提取試劑盒，操作按說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR Master Mix 10 μL，DNA 模板1 μL，正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收擴(kuò)增條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖2 豚鼠MC1R基因的編碼區(qū)、斷裂位點以及PCR擴(kuò)增引物示意圖
Fig. 2 The diagrammatic sketch of coding region， breakpoints and amplification primers ofMC1Rgene inCaviaporcellus

參考序列來源于NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的NT_176187.1， 陰影部分表示MC1R基因的編碼區(qū)， 水平箭頭表示引物的位置和擴(kuò)增方向， 垂直箭頭表示缺失發(fā)生的位置

Reference sequence is based on NT_176187.1 in NCBI nucleic acid database， the shadow region indicates the coding sequence ofMC1Rgene， the horizontal arrows indicate the positions and amplification direction of primers， and the vertical arrows indicate the breakpoints

表1 引物名稱、序列和位置Table 1 Name， sequence and location of primers

注： 引物序列的位置依據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的NT_176187.1

Note： Location of primer sequence is based on NT_176187.1 in NCBI nucleic acid database

1.3.3 序列比對和同源性分析采用DNAMAN進(jìn)行序列拼接和同源性分析，Primer Premier 5.0進(jìn)行編碼區(qū)氨基酸的翻譯。在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)物種MC1R基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.3.4 多態(tài)性位點的基因分型依據(jù)MC1R基因在野生型和黃毛色個體之間的DNA序列長度多態(tài)性，以T-MC-F、T-MC-R2和T-MC-3-R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對89只豚鼠進(jìn)行基因分型，其中包括58只野生型和31只黃毛色。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件與1.3.2相同。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據(jù)擴(kuò)增片段確定每只個體的基因型。

1.3.5 動物測交試驗與基因分型選取2只具有野生型表型的MC1R基因缺失雜合子雌性豚鼠與1只黃毛色雄性個體交配，對所有后代進(jìn)行基因型分析，基因型分型方法同上。

2 結(jié)果

2.1 MC1R基因編碼序列擴(kuò)增與分析

以T-MC-F和T-MC-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，2只野生型個體中均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，而黃毛色個體中沒有目的條帶擴(kuò)增。測序結(jié)果表明，野生型個體基因組中擴(kuò)增條帶為1 249 bp，包括 151 bp 的5’非翻譯區(qū)域、147 bp的3’非翻譯區(qū)域和951 bp的編碼序列(包括終止密碼子)。野生型豚鼠MC1R基因編碼氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的犬(AGG12071)、人Homosapiens(NP_002377)、小鼠(NP_032585)、兔(CBJ17601)、牛(NP_776533)和野豬(AQU43257)的同源性分別為78.4%、77.1%、77.0%、76.8%、75.9%和74.3%。

2.2 MC1R基因缺失位點的鑒定

由于引物T-MC-F和T-MC-R不能在黃毛色豚鼠中擴(kuò)增MC1R基因編碼區(qū)序列，推測該基因可能存在缺失多態(tài)性。在編碼區(qū)上游(5’端)設(shè)計了1對引物(T-MC-5-F1和T-MC-5-R1)，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在野生型和黃毛色豚鼠基因組中均能擴(kuò)增605 bp 的目的片段；在編碼區(qū)下游(3’端)設(shè)計了2對引物，其中引物組合T-MC-3-F1和T-MC-3-R1只能從野生型中擴(kuò)增323 bp目的片段，但引物組合T-MC-3-F2和T-MC-3-R2從野生型和黃毛色豚鼠中均能擴(kuò)增345 bp目的片段。以分別位于MC1R基因編碼區(qū)上游和下游引物T-MC-5-F1和T-MC-3-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，野生型豚鼠中無擴(kuò)增條帶，但黃毛色豚鼠中有1 196 bp特異性擴(kuò)增片段。然后分別以T-MC-5-F1和T-MC-R2以及T-MC-3-F1和T-MC-3-R2為引物組合對野生型豚鼠MC1R基因的5’端和3’端進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，證明黃毛色豚鼠該基因存在 2 760 bp 的缺失，其位于參考基因組(NT_176187.1)第603 260 bp至第606 019 bp，其中包括了整個編碼區(qū)和兩側(cè)部分序列(圖3)。

圖3 MC1R基因缺失區(qū)域的測序鑒定Fig. 3 Identification of the deletion region of MC1R gene by DNA sequencing

E. 野生型等位基因，e. 缺失突變等位基因

E. wild-type allele，e. allele of the deletion mutation

2.3 MC1R基因缺失多態(tài)性的基因分型

基因分型結(jié)果表明，在2種毛色表型個體中存在E和e2種等位基因，其中，引物T-MC-F和T-MC-R2 擴(kuò)增長度為288 bp的野生型等位基因(E)，而引物T-MC-F和T-MC-3-R2擴(kuò)增長度為448 bp的缺失等位基因(e)。58只野生型個體中，36只為EE純合子，22只為Ee雜合子，而31只黃毛色個體均為ee純合子。圖4為部分個體的基因分型電泳結(jié)果。

圖4 MC1R基因缺失多態(tài)性的基因分型Fig. 4 Genotyping of deletion polymorphism of MC1R gene

M. DL2000 DNA Marker， 1～10. 野生型豚鼠， 11～15. 黃毛色豚鼠

M. DL2000 DNA Marker， 1-10. wild-typeCaviaporcellus， 11-15. yellow-coated colorC.porcellus

2.4 MC1R基因多態(tài)性的系譜分析

通過測交試驗，2個家系共獲得15只后代，其中野生型個體8只，黃毛色個體7只，基因分型結(jié)果表明，8只野生型個體均為Ee雜合子，而7只黃毛色個體均為ee純合子(圖5)，表明豚鼠的隱性黃毛色符合常染色體隱性遺傳方式。

圖5 豚鼠MC1R基因多態(tài)性的系譜分析
Fig. 5 Pedigree analysis ofMC1Rgene polymorphism ofCaviaporcellus

○ 雌性野生型， □ 雄性野生型， ● 雌性黃毛色， ■ 雄性黃毛色

○ female wild-type， □ male wild-type， ● female yellow-coated， ■ male yellow-coated

3 討論

動物毛色形成過程從最開始的神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育為成熟的黑色素細(xì)胞，再到黑色素細(xì)胞分泌黑色素以及黑色素的包裝與轉(zhuǎn)運，整個過程受到眾多信號通路的調(diào)控，其中任一基因發(fā)生突變都將可能導(dǎo)致動物毛色的改變(Thomas & Erickson，2008)。目前，對動物毛色多樣性的分子遺傳基礎(chǔ)研究主要采用候選基因法、遺傳標(biāo)記連鎖分析法和基因組重測序法(Baueretal.，2018；Langevinetal.，2018)。

本實驗首先用T-MC-F和T-MC-R為引物對野生型和黃毛色豚鼠的編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)黃毛色豚鼠基因組中無擴(kuò)增片段，推測MC1R基因可能存在缺失，但缺失片段的大小和缺失區(qū)域并不清楚。因此，從MC1R基因編碼區(qū)的5’端和3’端開始分別設(shè)計引物擴(kuò)增不同的區(qū)域，直到能在2種毛色個體中均能成功擴(kuò)增為止。通過該方法將MC1R缺失區(qū)域定位于引物T-MC-5-F1和T-MC-3-R2之間；通過PCR擴(kuò)增與測序成功鑒定了黃毛色豚鼠MC1R等位基因e缺失的2 760 bp，包括MC1R基因的整個編碼區(qū)及部分側(cè)翼序列。Vidal(2018)對 3種毛色表型(黃/白、黑/黃/白和黑/白)豚鼠的MC1R基因編碼區(qū)進(jìn)行比較，鑒定了1個同義突變(c.654T>C)、2個錯義突變(c.749T>A和c.872C>T)和1個2 760 bp的缺失，群體基因分型和測交實驗證實c.749T>A多態(tài)性和缺失突變均與豚鼠的黃毛色相關(guān)。本實驗對2只野生型毛色豚鼠的MC1R基因編碼序列進(jìn)行了測序，獲得的序列與參考基因組序列完全相同；在純黃毛色的MC1R基因中發(fā)現(xiàn)了2 760 bp的缺失，其斷裂位點與Vidal(2018)所報道的一致(MH450219.1)。MC1R受體的缺失功能性突變可使黑色素合成過程中真黑色素向偽黑色素轉(zhuǎn)變(Rees，2000)，從而使動物的毛色表型發(fā)生改變，例如犬的MC1R受體第306位氨基酸由精氨酸到終止密碼子(R306ter)的無義突變與犬的黃毛色表型相關(guān)(Evertsetal.，2000；Newtonetal.，2000)。因此豚鼠黃毛色表型可能是由于MC1R基因部分序列的缺失從而不能產(chǎn)生有功能的MC1R受體所導(dǎo)致。

為了建立針對等位基因e的2 760 bp缺失的基因分型方法，本實驗在PCR擴(kuò)增體系中添加3條引物，T-MC-F和T-MC-R2引物組合能擴(kuò)增等位基因E上288 bp的片段，而T-MC-F和T-MC-3-R2引物組合能擴(kuò)增等位基因e上448 bp的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳能準(zhǔn)確區(qū)分3種基因型。由于等位基因E對e完全顯性，EE純合子和Ee雜合子的表型一致，從表型不能直接推測其基因型，利用本實驗建立的針對MC1R基因缺失的PCR分型方法可以簡單地確定各個體的基因型，從而加速豚鼠毛色純系選育的進(jìn)程。

4 結(jié)論

豚鼠MC1R基因存在2 760 bp的缺失多態(tài)性，包括全長編碼區(qū)和部分側(cè)翼序列。該缺失與豚鼠的黃毛色完全相關(guān)，即豚鼠黃毛色是由于MC1R基因的缺失所致。