劉昆昂 劉萌 張根偉

摘要：金針菇是雙因子控制的四極性異宗結(jié)合的食用菌，與其他異宗配合的食用菌一樣，主要采用選擇育種、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合和基因工程育種等育種方法進行育種，其中選擇育種是其他一切育種方法的基礎(chǔ)。雜交育種手段繁瑣費事，但目的性和方向性都比較明確，仍然是目前培育金針菇新的優(yōu)良菌株的真正有效方法。誘變育種多采用金針菇的原生質(zhì)體進行誘變，但誘變育種只擴大了變異范圍，并不能定向誘變，后期篩選工作將會十分繁瑣，誘變率也偏低。原生質(zhì)體融合方法具有重組頻率高、受結(jié)合型限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、重組體種類多、有助于外源基因轉(zhuǎn)化等特點。隨著各種測序技術(shù)和分析手段的不斷發(fā)展，金針菇的基因工程育種將成為未來菌株改良的新途徑。

關(guān)鍵詞：金針菇;選擇育種;雜交育種;誘變育種;原生質(zhì)體融合;基因工程育種

中圖分類號：S646.1+50.32 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0018-05

金針菇[Flammulina velutipes （Curt. Ex Fr.） Sing.]，別稱構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢菌，屬于擔子菌門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金錢菌屬（Flammulina）[1]。金針菇營養(yǎng)豐富、味道鮮美且兼具藥用價值，富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素和氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中人體所必需的8種氨基酸占氨基酸總量的44.5%，其中賴氨酸和亮氨酸等人體必需氨基酸的含量高于其他菇類，因此又稱增智菇。金針菇作為一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維來源，還具有促進消化、排除重金屬離子和降低膽固醇的作用，其中含有的多糖成分，還可預防高血壓和腫瘤等疾病，經(jīng)常食用可明顯提高人體免疫力。

金針菇在世界各地分布廣泛，主要集中在中國、日本和韓國等地，在國際食用菌市場上，金針菇的產(chǎn)銷量位居第4。20世紀60年代，日本開始通過空調(diào)設(shè)備與各種自動化裝置，實現(xiàn)了金針菇的工廠化栽培，整個金針菇栽培管理過程全部自動化。金針菇菌種作為發(fā)展金針菇的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料，對金針菇生產(chǎn)起著關(guān)鍵性作用，直接影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，金針菇生產(chǎn)與研究的關(guān)鍵是對具有高產(chǎn)、抗病、廣溫等優(yōu)良農(nóng)藝性狀菌株的篩選。

1 金針菇生活史

金針菇是雙因子控制的四極性異宗結(jié)合的食用菌，有性世代產(chǎn)生擔孢子，每個擔孢子產(chǎn)生4個擔孢子，交配型可以分為4種，分別為AB、ab、Ab、aB[2]。金針菇單個擔孢子發(fā)育而來的同核體菌絲為單核，無鎖狀聯(lián)合，單核菌絲也可以形成子實體，但與雙核相比子實體小且發(fā)育不良。具有可親和交配型的單孢菌絲經(jīng)過質(zhì)配形成異核體菌絲，異核體菌絲雙核，具有鎖狀聯(lián)合，雙核菌絲經(jīng)過發(fā)育后扭結(jié)形成原基，進而發(fā)育形成異核子實體，異核子實體的原擔子細胞為異核體，胞內(nèi)具有2個核，這2個核經(jīng)過核配融合為1個二倍核，二倍核的擔子進行減數(shù)分裂形成4個單倍子核，4個子核分別進入4個擔孢子中，隨著擔孢子繼續(xù)發(fā)育，其中的單核再進行1次有絲分裂，成熟擔孢子為雙核，但這2個核是同質(zhì)的。金針菇的無性階段，單核菌絲和雙核菌絲都可以產(chǎn)生單核的粉孢子，粉孢子在條件適宜時可以萌發(fā)出單核菌絲或者雙核菌絲[3]。

2 育種方法

2.1 選擇育種

選擇育種（selective breeding）是以食用菌的自然變異為基礎(chǔ)，有意識地控制和積累有益的突變，經(jīng)過不斷的優(yōu)勝劣汰，培育出新的優(yōu)良品種的育種方法，該方法操作簡單， 應(yīng)用廣泛，是最傳統(tǒng)的方法，也是各種育種方法的基礎(chǔ)[2]。目前用于人工栽培的食用菌菌種絕大多數(shù)都是由野生菌種馴化而來，馴化育種又稱為人工選擇，以品種在自然界中的變異為基礎(chǔ)，選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，我國引進和馴化栽培成功的食用菌已達80多個種[4]。野生育成的菌株具有菌柄粗、色澤深、菌蓋大、絨毛多、抗病性強、生物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點，并且子實體脆嫩，與野生菇一樣鮮美。我國金針菇種質(zhì)資源比較豐富，地方品種繁多[5]，須要充分了解當?shù)厥秤镁姝h(huán)境、生活習性以及遺傳特性等特征，利用孢子分離法或組織分離法進行分離，將篩選出的野生菌株不斷進行人工選擇，改變部分特性，逐漸培養(yǎng)為栽培種[6]。野生食用菌馴化栽培是食用菌育種的重要內(nèi)容。劉勝貴等對湖南省懷化市郊區(qū)采集的野生金針菇F9703菌株進行馴化，并與雜交19菌株在菌絲生活力、出菇特征、生物學效率等方面進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金針菇F9703菌株的菌絲生活力、生物學效率均強于雜交19菌株，但子實體外觀品質(zhì)略差[7]。周建林等對浙江省江山市主栽金針菇品種江山白菇進行組織分離，經(jīng)逐年自然篩選，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的白色金針菇新品種F21-2，該品種已成為浙江省金針菇栽培的重要品種[8]。馴化成功后，人們又采用雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合等多種方式進一步對該菌種進行改造，最終形成多個生產(chǎn)上常用的新菌株。

2.2 雜交育種

雜交育種（crossbreeding）也是食用菌常用的育種方法，著眼于雙親性狀的優(yōu)勢互補或借助于一親本的優(yōu)點去克服另一親本的缺點，其目的性及方向性都比較明確[9]。選擇適當?shù)挠H本是雜交育種成功的關(guān)鍵，首先選擇的2個親本都應(yīng)該具有突出的優(yōu)點，其次親本之間應(yīng)具有較大的遺傳差異，再次親本之間應(yīng)具有較好的配合力。雜交育種一般費時費力，且對各項操作步驟要求都較高，但卻是目前食用菌育種最常用的方法，尤其在異宗結(jié)合的食用菌新品種選育中使用最廣泛，收效最顯著[6]。金針菇是異宗結(jié)合的食用菌，可以利用不同性別的單核菌絲進行雜交，其雜交方法有單孢雜交和多孢雜交，目前雜交育種是對金針菇品種改良和選育最有效的方法[10]。食用菌雜交育種主要分為單單雜交、雙單雜交和多孢雜交，單單雜交配對后的雜交菌株必須通過出菇試驗確定優(yōu)劣。自然界中單單雜交的機會極少，多數(shù)是多孢雜交獲得的優(yōu)勢菌株，這些菌株具有菇形圓整、抗病力強等優(yōu)點[11-12]。

金針菇雜交19號菌株，是以日本信濃二號和三明一號為親本進行多孢子雜交選育出來的一個優(yōu)良雜交菌株，于1988年年底通過鑒定[13]。F-7是以雜交19為親本，通過多孢雜交選育而成的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌株，其色澤黃白，外形美觀，菌柄基部無褐色，菌柄細而挺直，菌蓋小，耐高溫能力強[14]。王波等對從Fv12中分離出的單孢菌株進行兩兩相互配對雜交，共配對雜交組合228個，以鎖狀聯(lián)合為標記鑒別雜交種，確定雜交菌株有72個，雜交率為31.6%，經(jīng)過初篩和復篩，得到1株較優(yōu)良的菌株川金2號[15]。王波等通過黃色金針菇與白色金針菇雙單雜交選育出了金針菇新品種川金3號，該品種于2006年通過四川省農(nóng)作物品種審定委員會審定[16]。徐珍等以金針菇菌株F3-31和FM-83為親本，利用單孢子分離技術(shù)，經(jīng)過單單雜交選育出菇形好、生育期短、產(chǎn)量高的白色優(yōu)良菌株G1，彌補了F3-31顏色淺黃、菌蓋傘形、產(chǎn)量較低和FM-83生育期長、抗性差的不足[17-18]。金針菇農(nóng)金6號是以黃色品種三明一號與白色品種金21、金3為親本通過雜交選育獲得的1株菇形好、生育期短、產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣的白色金針菇菌株，于2012年4月通過福建省農(nóng)作物品種審定委員會認定[19]。王波等以黃色金針菇與白色金針菇為親本，通過雙單雜交獲得雜交種后再自交得到早熟白色金針菇F2121，再分別與白色金針菇F21和金白F4的雙核體進行雙單雜交，獲得優(yōu)良白色金針菇川7金號和川金8號[20]。金針菇川金33是以早熟白色金針菇菌株F363和晚熟白色金針菇菌株FNK1302為親本，通過雙單雜交選育出來的，其子實體白色，菌蓋大、不易開傘，菌柄粗壯、基部不粘連，該品種于2016年通過四川省農(nóng)作物品種審定委員會審定并大面積示范應(yīng)用[21]。

雜交育種的一般程序：（1）選擇具有優(yōu)良目的性狀的親本且孢子成熟的子實體，收集孢子;（2）采用玻片稀釋法、平板稀釋法和顯微操作器分離法進行單孢分離;（3）單單雜交，先對單孢子進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上接入2個雜交親本的單核菌絲各1塊，2單孢菌絲接觸后，鏡檢接觸處的菌絲體，挑取雙核菌絲;雙單雜交，即雙核親本與另一個單核菌絲親和，配對成功;多孢雜交，是直接將稀釋后孢子涂平板，挑取生長速度快的菌絲進行雙核鑒定;（4）得到一定數(shù)量的雜交菌株后，要選擇適當?shù)脑耘喾绞綄?yōu)良菌株進行篩選和驗證，包括生產(chǎn)性狀、抗逆性等;（5）將初步篩選出的雜交菌株通過進一步的生產(chǎn)試驗（包括區(qū)域性試驗）來進行復篩，從而更加確定雜交菌株的各種性狀，預估出雜交菌株的生產(chǎn)價值和推廣價值，對于各項性狀都理想的菌株要保留，并及時進行推廣，獲得優(yōu)良菌株[22]。

2.3 誘變育種

誘變育種（mutation breeding）是人為利用某些物理或化學因子處理細胞群體，促使其中少數(shù)細胞的遺傳物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起其遺傳性變異，再從多種突變體中選出正突變菌株的方法，誘變育種也是獲得優(yōu)良食用菌菌株的常用手段之一[2]。遺傳育種上常用的突變株有營養(yǎng)缺陷突變株，如氨基酸、維生素、堿基等合成能力有缺陷的突變株;另外還有溫度敏感突變株，指可在某一溫度條件下生長而在另一溫度條件下不生長的突變株;還有一種是對某種藥物具有一定抵抗力的突變株，通過誘變劑處理孢子可以提高產(chǎn)生抗性突變的幾率。

誘變育種技術(shù)主要包括物理誘變和化學誘變，當前金針菇常用的物理誘變主要包括紫外線（UV）、60Co-γ射線、激光、微波、常壓室溫等離子體（ARTP）及航空等誘變。F8815和F8817是以三明一號為出發(fā)菌株，選用菌絲原生質(zhì)體為誘變材料，經(jīng)γ射線輻射誘變，從雙核再生株中選育出來的，這是食用菌中首例采用原生質(zhì)體誘變方法選育出來的子實體色澤淺、產(chǎn)量高并表現(xiàn)出廣溫出菇的新品種，于1992年12月通過部級成果鑒定[23-24]。成亞利等用紫外線照射金針菇Y(jié)19和W088菌株原生質(zhì)體1 min，再生后挑選生長好的菌株，與出發(fā)菌株相比，變異菌株生長速度提高23.1%～52.3%，出菇時間提早10～14 d[25]。李耀維等用He-Ne激光輻照誘變金針菇三明1號的原生質(zhì)體、菌絲體片段和分生孢子懸液，通過初篩、復篩及突變株遺傳穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，采用原生質(zhì)體進行誘變，其正突變率、單株超氧化物歧化酶（SOD）產(chǎn)量提高率、產(chǎn)SOD遺傳穩(wěn)定性均高于菌絲體與分生孢子[26]。周丹對金針菇F40原生質(zhì)體進行紫外誘變處理，經(jīng)過初篩和復篩，選出硒含量和生物量明顯高于出發(fā)菌株的突變株Y12和Y57[27]。解生權(quán)等通過對市售金針菇馴化后的菌株進行紫外誘變處理60 min，獲得了比原菌絲體生長能力旺盛的菌種，誘變菌種的斜面培養(yǎng)時間為7～10 d[28]。陳力力等比較了紫外線和微波單因子對金針菇J05Y-c單細胞懸液的誘變效應(yīng)，通過比較誘變致死率、正變率、透明圈直徑與菌落直徑比例（HC值）、菌絲生長量和傳代穩(wěn)定性進行優(yōu)勢菌株篩選，結(jié)果表明，誘變效應(yīng)的最佳劑量范圍在致死率為75%～90%的處理組，相同處理時間內(nèi)，微波誘變的正變率大于紫外誘變;采用最大功率為 700 W、脈沖頻率為2 540 MHz的微波爐，以中等功率強度處理80 s，獲得HC值、菌絲生長量比出發(fā)菌株提高32.38%、62.16% 的優(yōu)勢突變株W8011，連續(xù)8次傳代遺傳性能穩(wěn)定[29]。張誠等將金針菇品種江山白F21菌絲體通過返回式衛(wèi)星進行航天搭載，從7個變異菌株中篩選獲得金針菇新品種航金1號，與出發(fā)菌株相比，該品種菇形好、早熟、產(chǎn)量高、耐高溫和適應(yīng)性廣[30]。楊茹等采用常壓室溫等離子體對菌株AR0進行處理，通過抗病性、纖維含量及親緣關(guān)系測定，篩選出菌株AR12和AR17，AR12與出發(fā)菌株相比抗托拉斯假單胞桿菌能力提高15.49%，菌絲體纖維含量降低1582%;AR17抗托拉斯假單菌能力提高1.90%，菌絲體纖維含量降低36.31%[31]。

金針菇常用的化學誘變劑主要有氯化鋰、甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯和亞硝基胍（NTG）、亞硝酸等，目前多采用化學誘變結(jié)合物理誘變的方式對金針菇進行處理?？盗种サ炔捎米贤庹T變、硫酸二乙酯誘變以及紫外、氯化鋰和硫酸二乙酯復合誘變這3種方法獲得高溫節(jié)能型金針菇新菌株FLAIUV、FLAIEMs、FLA7EMS、FLAIUV+LICIEMS，其菌絲可在33 ℃高溫下正常生長、在20 ℃下可以正常發(fā)育形成子實體[32]。金玲等利用60Co-γ射線誘變金針菇原生質(zhì)體，對金針菇73#進行改良，培養(yǎng)出生物轉(zhuǎn)化率高、品質(zhì)優(yōu)良且產(chǎn)量較高的金針菇新菌株5-114，克服了親本采后基部易變褐的缺點，加快了育種過程，縮短了育種周期[33]。楊宗渠等用 60Co-γ 射線處理野生種馴化菌株F126F的雙核菌絲，經(jīng)過篩選培育出菌絲生長快、抗雜力較強、產(chǎn)量高的金針菇新菌株輻金1號[34-35]。李蕤等通過對白金針2號菌絲進行機械破碎，獲得了菌絲斷片單細胞懸液，利用紫外線及亞硝酸對其誘變，并利用透明圈法測定正變率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同菌齡菌絲斷片對紫外線的敏感性較亞硝酸低，2種處理中較高的正變率都出現(xiàn)在平臺期之后，即亞硝酸誘變時間40～50 s，紫外線誘變時間120～140 s，傳代試驗證明，獲得的突變株遺傳性狀較穩(wěn)定[36]。羅潤以黃色金針菇菌株FV7為材料，采用紫外線、氯化鋰和甲基磺酸乙酯（EMS）等多種誘變方法對金針菇的菌絲細胞進行誘變，誘變后的菌絲細胞經(jīng)過菌絲體生長階段 33 ℃ 高溫初篩和子實體發(fā)育階段20 ℃中溫復篩，獲得耐高溫突變菌株FV7EMS，該菌株生長速度快、菌柄較長，生物學效率較系本FVT提高28.82%[37]。

誘變育種通過誘使金針菇野生菌株或者栽培菌株發(fā)生變異，從中篩選出生長期短、產(chǎn)量高、品質(zhì)好的菌株，多采用金針菇的原生質(zhì)體進行誘變，但誘變育種只擴大了變異范圍，并不能定向誘變，篩選工作將會十分繁瑣，誘變率也偏低，且誘變性狀不夠穩(wěn)定，容易引起長出畸形菇。

2.4 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體就是在人工條件下人為去除細胞壁的裸露細胞。19世紀末Hanstein最早提出原生質(zhì)體的概念，原生質(zhì)體具有完整新陳代謝功能，可完成所有生命活動，是由細胞質(zhì)膜、細胞質(zhì)和細胞核組成的有機整體[38]。隨著對原生質(zhì)體的不斷研究，在20世紀60年代誕生了原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）技術(shù)，該技術(shù)可使不同遺傳類型原生質(zhì)體的基因組進行交換和重組，產(chǎn)生具有親代遺傳特性的全新品種[39]。原生質(zhì)體融合方法具有重組頻率高、受結(jié)合型限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、重組體種類多、有助于外源基因轉(zhuǎn)化等特點。

原生質(zhì)體融合前首先要獲得原生質(zhì)體，起初人們使用超聲波和研磨等物理方法制備原生質(zhì)體，但這些方法對細胞損傷大，制備的原生質(zhì)體質(zhì)量不高[40]。隨后，酶技術(shù)和生物工程技術(shù)的發(fā)展為原生質(zhì)體的制備提供了新的方法，成為食用菌原生質(zhì)體制備的主要方法。目前，在食用菌領(lǐng)域酶解細胞壁使用的酶主要有幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蝸牛酶、溶壁酶、溶菌酶等，不同食用菌的細胞壁組成不同，需要根據(jù)所要制備的原生質(zhì)體的種類選擇不同的酶[41]。田娟等使用溶壁酶處理香菇和金針菇單核菌絲獲得原生質(zhì)體并進行了原生質(zhì)體融合，從142個融合子中獲得17個能出菇的菌株[42]。除了酶的選擇外，菌齡、酶的濃度、穩(wěn)滲劑、酶解時間、培養(yǎng)基成分和溫度等都是影響原生質(zhì)體制備的重要因素[43-44]。有報道采用正交試驗方法對影響金針菇原生質(zhì)體制備和再生的因素進行了研究，為后續(xù)的金針菇原生質(zhì)體融合育種的研究提供了重要參考，該報道提供了金針菇原生質(zhì)體制備和再生的最佳體系[45]。金針菇的原生質(zhì)體融合以聚乙二醇（PEG）作為融合劑的化學法最常用[46]。在原生質(zhì)體融合后需要對融合子進行篩選，融合子的篩選方法很多，需要根據(jù)試驗材料和試驗?zāi)康牟煌M行篩選，抗藥性、熒光染色、營養(yǎng)缺陷型和應(yīng)用原生質(zhì)體滅活都是較為常用的方法[47-48]。篩選出的融合子要進行鑒定以確認融合子的真實性，常用的融合子鑒定方法分為生物學鑒定和DNA分子標記鑒定二大類，其中生物學鑒定主要是拮抗作用和鎖狀聯(lián)合等特征的鑒定，分子標記鑒定主要采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記技術(shù)、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）標記技術(shù)和簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）技術(shù)[49]。這些方法各自存在一定的局限性。鎖狀聯(lián)合為許多擔子菌菌絲所特有的一種細胞結(jié)構(gòu)，香菇、金針菇和木耳等菌株的融合均可以鎖狀聯(lián)合作為判定的自然標記，而雙孢蘑菇、草菇等卻不能使用該標記[50-52]。RFLP技術(shù)雖然效果穩(wěn)定，但試驗周期長、方法復雜等不利因素限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[49]。

2.5 基因工程育種

基因工程育種（genetic engineering）就是人為從某一供體生物中提取所需的目的基因，在離體條件下采用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割后，將它與載體DNA分子連接起來一并導入到受體生物細胞中進行復制和表達，從而選育出新物種?；蚬こ逃N是一種比常規(guī)育種優(yōu)越得多的定向育種新技術(shù)，可以通過跨屬親本或多親本的遞推融合和高通量篩選實現(xiàn)食用菌基因組改組，將所有親本中的優(yōu)良基因集合到食用菌子代細胞上[53]。

隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，金針菇的基因組及轉(zhuǎn)錄組陸續(xù)被測定，這對基因工程育種與分子輔助育種具有很大的參考作用。2011年，張光忠對金針菇單核菌株L11與W23的基因組進行了測序，拼接和組裝后，根據(jù)基因組序列的差異區(qū)域，設(shè)計顯性的特異性片段擴增區(qū)域（SCAR）標記引物[54]。2013年，王威對金針菇L11與W23的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，數(shù)據(jù)揭示了HD基因在不同生長發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄水平的表達規(guī)律，總體表現(xiàn)為在單核菌絲時期表達量偏低，當質(zhì)配為雙核菌絲后，在雙核菌絲內(nèi)表達量明顯升高，發(fā)育出原基后，表達量持平或下降[12]。在金針菇L11基因組和H1123轉(zhuǎn)錄組序列測定以及基因注釋基礎(chǔ)上對金針菇淀粉酶家族基因及萜類合成途徑中的關(guān)鍵基因進行了信息分析[55-56]。劉建雨等對金針菇Dan3全基因組序列進行了測定，得到了大小為 34.17 Mb 的基因組，并預測到8個參與α-氨基己二酸途徑的關(guān)鍵基因[57]。

作為基因工程育種的核心環(huán)節(jié)，目前在食用菌領(lǐng)域常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導法、電激法、限制酶介導法、PEG法等[58]。李巍等以白金針菇菌絲球為受體材料，通過金針菇表達載體p139035S-bFGF，用根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）[59]。施樂樂等通過根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的方法，以金針菇菌絲球為受體材料轉(zhuǎn)入含該內(nèi)源HMG-box轉(zhuǎn)錄因子的過表達載體，并對1個內(nèi)源HMG-box轉(zhuǎn)錄因子fvhom1進行了基因結(jié)構(gòu)和表達量分析，獲得了1個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子[60]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是繼鋅指核酸酶（ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）之后的新一代基因組編輯技術(shù)，其基本作用原理是通過向?qū)gRNA引導的核酸內(nèi)切酶Cas9切割目標基因，形成DNA雙鏈斷裂缺口，再利用細胞自身的同源重組和非同源末端連接2種修復途徑，實現(xiàn)基因定點編輯[61]。因其載體設(shè)計操作簡單、編輯高效且通用性廣，已成為基因組定向改造和基因功能驗證的重要方法。羅潤等采用CRISPR/Cas9高效基因編輯系統(tǒng)，構(gòu)建了金針菇基因敲除載體及轉(zhuǎn)化體系[62]。劉建雨等構(gòu)建了FvCas9雙元表達載體，利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化金針菇單核體Dan3，抗性篩選后顯示，Cas9基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到金針菇菌絲體中[63]。

3 展望

初期栽培的菌株均為野生馴化育成的菌株，我國有豐富的食用菌種質(zhì)資源，廣泛收集的不同地域和不同生態(tài)型菌株，可作為金針菇遺傳育種的原始資源，若用于大面積栽培，還須對野生種加以改良。雜交育種手段繁瑣費事，但只限于種內(nèi)雜交，雜交育種的目的性和方向性都比較明確，仍然是目前培育金針菇新的優(yōu)良菌株的真正有效方法。誘變育種多采用金針菇的原生質(zhì)體進行誘變，但誘變育種只擴大了變異范圍，并不能定向誘變，篩選工作將會十分繁瑣，誘變率也偏低，且誘變性狀不夠穩(wěn)定，容易引起長出畸形菇。原生質(zhì)體融合方法具有重組頻率高、受結(jié)合型限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整、重組體種類多、有助于外源基因轉(zhuǎn)化等特點。基因工程育種以分子生物學理論為基礎(chǔ)，為面臨諸多問題的食用菌常規(guī)育種提供了新的選擇。目的基因的獲取是基因工程育種的前提[64]，隨著各種測序技術(shù)和分析手段的不斷發(fā)展，目的基因的獲取不再困難。金針菇高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立，基因定點編輯的技術(shù)-CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用在酵母、煙曲霉、里氏木霉和稻瘟病菌等真菌中[65-68]，在金針菇上也已經(jīng)開始應(yīng)用，這些都使金針菇的基因工程育種成為未來菌株改良的新途徑。

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