王一霖， 滕 亮， 王中志， 王 妍， 林文婷， 陳江漢

新生隱球菌是一種環(huán)境致病菌，可以感染人類和許多哺乳動物的肺、皮膚、骨骼等全身各器官，但以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見（即為隱球菌性腦膜炎）。據(jù)估計，僅2014年就新增223 100例隱球菌性腦膜炎病例，其中73%發(fā)生在非洲[1]。與歐美、非洲等地區(qū)隱球菌性腦膜炎主要發(fā)生在AIDS人群不同，我國主要發(fā)生在非AIDS的無免疫功能缺陷的人群，但在治療上卻比免疫功能受損的患者療程更長，治療更困難[2]。隱球菌性腦膜炎患者如不及時治療，86%在1年內(nèi)死亡，即使現(xiàn)代醫(yī)療的情況下，病死率仍有20%～30%[3]。因此，如何有效防治新生隱球菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，是目前亟需解決的問題。

微小RNA（miRNA）是一類長度約為20～24個核苷酸非編碼小RNA分子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等多種生命活動。miR-155-5p參與免疫細(xì)胞的發(fā)育分化，在活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[4-5]。核因子κB抑制蛋白E（IKBKE）是IκB激酶家族（IKKs）新近發(fā)現(xiàn)的成員，可通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[6]。通過前期mirnada網(wǎng)站預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p和IKBKE基因有結(jié)合位點(diǎn)，而miR-155-5p和IKBKE基因均參與細(xì)胞炎性反應(yīng)，因此猜測miR-155-5p通過靶向降解IKBKE信使RNA（mRNA）在人單核巨噬細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）抗新生隱球菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮著作 用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株WM148來自上海長征醫(yī)院皮膚科真菌儲藏室；胎牛血清購自Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、Opti-MEM培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone；腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-6 Elisa試劑盒來自中國欣博盛生物科技公司；異丙醇、三氯甲烷和無水乙醇來自鼎國生物技術(shù)有限公司；miR-155-5p mimics、IBKEK siRNA購自中國銳博生物公司；miR-155-5p、U6引物購自上海生工生物工程公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol購自TaKaRa公司；實(shí)時熒光PCR試劑盒購自ABM公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；X-tremegene HP購自羅氏公司；佛波酯（PMA）購自SIGMA公司；脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞、菌株培養(yǎng) THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中；2～3 d換液1次，細(xì)胞密度達(dá)80%時傳代培養(yǎng)。WM-148標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)于YEPD培養(yǎng)基（2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母提取物）中，30 ℃培養(yǎng)，收集菌株予0.9% NaCl溶液沖洗2遍后65 ℃條件下滅活1 h，計數(shù)并調(diào)整菌液濃度。

1.2.2 細(xì)胞分組、干預(yù)及收集樣品 將濃度為1×106/mL的THP-1細(xì)胞液2 mL接種于6孔板，每孔加入200 ng PMA，48 h誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，按照菌與細(xì)胞5∶1數(shù)量比加入已滅活的新生隱球菌進(jìn)行干預(yù)，在0 h、3 h、6 h、9 h和12 h時間點(diǎn)離心收集細(xì)胞及上清液，保存于-80 ℃冰 箱。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及qPCR檢測 Trizol法提取總RNA后，利用紫外分光光度計將RNA濃度調(diào)整至500 ng/μL左右，miR-155-5p反轉(zhuǎn)錄10 μL體系（mRQ緩沖液5 μL、mRQ酶混合物1.25 μL及RNA樣品3.75 μL），反應(yīng)條件為37 ℃ 1 h、85 ℃5 min；IKBKE反轉(zhuǎn)錄10 μL體系（5×PrimeScript RT預(yù)混合溶液2 μL、RNA樣品500 ng、無酶水加至10 μL），反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s；miR-155-5p及U6實(shí)時熒光PCR 25 μL體系[無酶水9.5 μL、SYBR 12.5 μL、MRQ 3'引物0.5 μL（U6上游引物）、miRNA引物0.5 μL（U6下游引物）、cDNA 2 μL]，反應(yīng)步驟為：①95 ℃ 5 min，②95 ℃ 10 s，③63 ℃ 15 s，④72 ℃ 5 s（步驟②～④重復(fù)40個循環(huán)），進(jìn)行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達(dá)量。引物見表1。

1.2.4 檢測上清液TNF-α和IL-6含量 利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，于分光光度計450 nm處檢測各組吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程計算各組細(xì)胞因子的濃度。

表1 qRT-PCR引物信息表Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR in this study

1.2.5 驗證miR-155-5p與IKBKE基因的靶向關(guān)系 將實(shí)驗分為6組，分別是海腎熒光素酶（pRL）質(zhì)粒+模擬物（mimics）陰性對照（NC）、pRL質(zhì)粒+miR-155-5p、pRL質(zhì)粒+IKBKE 3'UTR+mimicsNC、pRL質(zhì)粒+IKBKE 3'UTR+ miR-155-5p、pRL質(zhì)粒+IKBKE 3'UTR-突變型（mut）+mimicsNC、pRL質(zhì)粒+IKBKE 3'UTR-mut+miR-155-5p。將生長良好的細(xì)胞分入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，按實(shí)驗設(shè)計的組別進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記基因的表達(dá)情況，然后使用“Dual-Luciferase?Reporter Assay System（E1910，promega）”試劑盒處理細(xì)胞、進(jìn)行熒光素酶表達(dá)檢測。

1.2.6 IKBKE siRNA的轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗分為空白對照組和轉(zhuǎn)染IKBKE siRNA組，用不含抗生素和血清的培養(yǎng)基稀釋IKBKE siRNA后，將其加入生長良好的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后測定IKBKE、TNF-α和IL-6的表達(dá)變化。

1.2.7 miR-155-5p mimics的轉(zhuǎn)染 更換細(xì)胞液，調(diào)整好細(xì)胞生長的狀態(tài)；將實(shí)驗分為4組，分別是0 h對照組、6 h對照組、0 h mimics組、6 h mimics組，用脂質(zhì)體2000試劑盒，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，實(shí)驗組轉(zhuǎn)染miR-155- 5p mimics，對照組轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics對照物，檢測轉(zhuǎn)染效率，提取RNA和上清液進(jìn)行下一步實(shí) 驗。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 根據(jù)SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，各組間的兩兩差異比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p、IKBKE、TNF-α和IL-6在新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞后的表達(dá)變化

新生隱球菌誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞后，以0 h為對照，miR-155-5p在3 h、6 h、9 h、12 h表達(dá)量均升高，其中在6 h升高最為顯著（P＜0.01），隨后逐漸下降；IKBKE在3 h、6 h、9 h下降量與0 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中在6 h下降最顯著（P＜0.01），TNF-α和IL-6表達(dá)逐漸增加，其中TNF-α在9 h達(dá)到峰值。見圖1。

2.2 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-155--55pp和IKBKE 3'非翻譯區(qū)（3' UTR）區(qū)域的相互作用

根據(jù)mirnada網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果，miR-155-5p和IKBKE基因有結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。雙熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)一步驗證了這一點(diǎn)：miR-155-5p作用后IKBKE 3'UTR活性下降了30%，說明miR-155-5p能夠作用IKBKE 3'UTR區(qū)域，引起IKBKE 3'UTR活性下降；將IKBKE 3'UTR進(jìn)行突變后，IKBKE 3'UTR-mut活性較野生型增加15%，而與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B），說明突變位點(diǎn)對miR-155-5p的結(jié)合很重要，可能是其相互結(jié)合的位點(diǎn)。見圖2。

2.3 miR-155-5p通過調(diào)控IKBKE進(jìn)一步調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞的功能

經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics，miR-155-5p實(shí)驗組較對照組在6 h表達(dá)明顯增加，證明轉(zhuǎn)染效率較高，相對應(yīng)IKBKE基因6 h實(shí)驗組較6 h對照組表達(dá)下降，進(jìn)一步驗證了miR-155-5p與IKBKE的靶向關(guān)系；檢測上清液因子發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組 TNF-α和IL-6在6 h表達(dá)均較對照組增加，表明miR-155-5p表達(dá)增加促進(jìn)了THP-1細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達(dá)。見圖 3。

圖1 新生隱球菌誘導(dǎo)后miR-155-5p和IKBKE的表達(dá)倍數(shù)變化以及TNF-α和IL-6的表達(dá)量變化Figure 1 Fold change of miR-155-5p expression and IKBK expression，TNF-α expression and IL-6 expression at different time points after induction by C. neoformans

圖2 miR-155-5p和IKBKE基因的結(jié)合位點(diǎn)（A）及雙熒光素酶報告系統(tǒng)中IKBKE 3'UTR和IKBKE 3'UTR-mut的活性變化（B）Figure 2 Binding site of miR-155-5p and IKBKE（Panel A）， activity change of IKBKE 3'UTR and IKBKE 3'UTR-mut in the dual luciferase reporter system（Panel B）

2.4 IKBKE siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后TNF-α和ILL--66的表達(dá)變化

經(jīng)轉(zhuǎn)染IKBKE siRNA，IKBKE含量在6 h下降，表明轉(zhuǎn)染效率較高，而TNF-α和IL-6在6 h表達(dá)增加，表明經(jīng)抑制IKBKE能夠促進(jìn)TNF-α和IL-6的表達(dá)。見圖4。

3 討論

發(fā)生在我國免疫正常人群的隱球菌性腦膜炎病原菌多為新生隱球菌，該病病情兇險，病死率高，療程長，治療費(fèi)用高，對患者和社會都是沉重的負(fù)擔(dān)，迫切需要對其發(fā)病機(jī)制及治療手段進(jìn)行研究[2]。

THP-1細(xì)胞是人體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在外界因素刺激下可被激活為經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞（M1型）和替代激活巨噬細(xì)胞（M2型）：M1型細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，具有很強(qiáng)的殺菌作用；M2型巨噬細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因（TGF）-β、精氨酸酶1（Arg1）、IL-10等炎性因子，可抑制炎性反應(yīng)[7]。在新生隱球菌性腦膜炎患者中，M1型細(xì)胞有助于清除病原體，而M2型細(xì)胞介導(dǎo)免疫逃逸[8]，因此促進(jìn)THP-1細(xì)胞向M1型極化有助于治療隱球菌性腦膜 炎。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics及其對照物后，miR-155-5p和IKBKE的表達(dá)倍數(shù)變化及TNF-α和IL-6的表達(dá)量變化Figure 3 After transfection of miR-155-5p mimics and its controls， the fold change of expression of miR-155-5p and IKBKE and the changes of expression levels of TNF-α and IL-6

圖4 轉(zhuǎn)染IKBKE siRNA及其對照物后IKBKE的表達(dá)倍數(shù)變化及TNF-α和IL-6的表達(dá)量變化Figure 4 After transfection of IKBKE siRNA and its controls， the fold change of expression of IKBKE and the changes of expression levels of TNF-α and IL-6

通過研究新生隱球菌干預(yù)THP-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p在6 h時間點(diǎn)表達(dá)增加，同時炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)明顯增加，而IKBKE基因在6 h表達(dá)減少，因此推測miR-155-5p通過靶向降解IKBKE mRNA促進(jìn)TNF-α和IL-6的表達(dá)。之后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)在miR- 155- 5p mimics作用下，IKBKE 3'UTR活性下降，將3'UTR突變其活性再次增加，證實(shí)miR-155-5p可與IKBKE 3'UTR結(jié)合。隨后我們對miR-155-5p功能進(jìn)行了研究，在miR-155-5p mimics作用下，與對照組比較，實(shí)驗組在6 h時IKBKE表達(dá)降低，TNF-α和IL-6表達(dá)明顯增加，表明miR-155-5p促進(jìn)TNF-α、IL-6的表達(dá)。為了驗證miR-155-5p通過靶向調(diào)控IKBKE發(fā)揮了此作用，我們將IKBKE siRNA轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)在6 h時IKBKE表達(dá)減少，同時TNF-α和IL-6表達(dá)增加。

綜上所述，本研究顯示并驗證了miR-155-5p通過靶向降解IKBKE mRNA促進(jìn)TNF-α和IL-6的表達(dá)這一調(diào)控機(jī)制。根據(jù)已知研究結(jié)果可知TNF-α和IL-6是M1型巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子，該細(xì)胞為促炎類型的巨噬細(xì)胞，具有強(qiáng)效殺菌特點(diǎn)并促進(jìn)輔助性T細(xì)胞1型參與的免疫反應(yīng)（Th1型免疫反應(yīng)），其在隱球菌性腦膜炎病程中發(fā)揮抗感染殺菌作用[5]。因此miR-155-5p可作為隱球菌性腦膜炎潛在的治療靶點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。盡管發(fā)現(xiàn)IKBKE在隱球菌干預(yù)THP-1細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但其作用的炎癥通路和具體分子機(jī)制仍然不清楚，需要進(jìn)一步探索和研究。