楊 敏，張 凱，李建喜，王 磊，張 康，仇正英，王學(xué)智

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730050)

H9C2心肌細(xì)胞用于篩選臨床藥物時(shí)，常面臨藥物溶解度低的問(wèn)題，因此篩選助溶劑是溶解藥物的關(guān)鍵一步。助溶劑必須滿(mǎn)足低毒、助溶效果優(yōu)良、不改變藥物本身的特性。二甲基亞砜(DMSO)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為較常用的有機(jī)助溶劑。DMSO是一種廣泛使用的可溶于水的非質(zhì)子溶劑，增溶能力強(qiáng)，低毒，具有透過(guò)生物膜的能力，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-2]。DMF則作為最有效的極性溶劑之一，有很好的溶解性，高沸點(diǎn)，低毒性，價(jià)格低廉，在有機(jī)合成、高分子制備、制藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3]。DMSO與DMF都具有低毒性，但對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的毒性作用有待進(jìn)一步研究。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路與心臟炎癥、血管再生、腫瘤、新陳代謝密切相關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，影響bcl-2、cyclinD1、matrix metalloproteinase-2基因轉(zhuǎn)錄活性[4-5]。當(dāng)抑制STAT3活性時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，激活STAT3，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[6]。DMSO與DMF對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用，可能與STAT3信號(hào)通路的調(diào)控相關(guān)。通過(guò)MTT法和Western blot試驗(yàn)，檢測(cè)DMSO和DMF不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的毒性作用與STAT3蛋白表達(dá)影響，以期為H9C2心肌細(xì)胞試驗(yàn)藥物助溶劑的選擇提供參考，為研究H9C2心肌細(xì)胞的STAT3蛋白通路相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、0.25%的胰蛋白酶、無(wú)菌PBS，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMSO和DMF，購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；MTT、彩虹180光譜蛋白Marker、5% BSA封閉液，均購(gòu)自Solarbio公司；M-PER細(xì)胞裂解液，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Beta Actin Mouse McAb抗體，購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；STAT3兔單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Bcl-2兔多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；山羊抗鼠和山羊抗兔多克隆抗體，購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自Heal Force廣州安邦生物公司；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，購(gòu)自美國(guó) Nexcelom 公司；離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡，購(gòu)自德國(guó)徠卡LEICA公司。

1.3 細(xì)胞來(lái)源

鼠源H9C2心肌細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4 H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)

制備含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，于-80 ℃取出H9C2細(xì)胞凍存管，立即放入37 ℃水浴，當(dāng)心肌細(xì)胞完全融化后，加入DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，4 ℃，1 000 r·min-1，離心5 min后，棄去細(xì)胞液，加入DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)液，輕輕吹打底部細(xì)胞懸浮后，接種至75 mm2細(xì)胞瓶，37.5 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)2～3 d。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)平鋪細(xì)胞量為90%以上，進(jìn)行細(xì)胞傳代，完全棄掉細(xì)胞液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶，37.5 ℃消化2 min，輕拍細(xì)胞瓶，促使細(xì)胞消化完全，加入10 mL含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.5 配制不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO和DMF培養(yǎng)液

分別取10、20、30、50、70、90、100、200、300 μL的DMSO和DMF分別加入10 mL的DMEM高糖完全細(xì)胞培養(yǎng)液中，配比為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%體積分?jǐn)?shù)的DMSO與DMF細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)0.22 μm·L-1的微孔濾膜過(guò)濾除菌后分別加入75 mm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)

將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞制備為細(xì)胞懸液，以1×105mL-1的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，加入不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO和DMF，每孔重復(fù)5個(gè)平行試驗(yàn)，共設(shè)置7列試驗(yàn)組(加入含不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO和DMF)，2列對(duì)照組(細(xì)胞加培養(yǎng)液)，1列空白組(無(wú)細(xì)胞，只加細(xì)胞培養(yǎng)液)，圍繞試驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組外圈每孔加入100 μL無(wú)菌PBS，置于5% CO2的37.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。避光使用無(wú)菌PBS配制5 mg·mL-1的MTT溶液，經(jīng)0.22 μm·L-1的微孔濾膜過(guò)濾除菌，試驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組每孔加入20 μL，在含5% CO2的37.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，徹底吸棄除無(wú)菌PBS孔的液體后，每孔加入150 μL DMSO，輕輕吹打幾下，低速振蕩10 min，置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，設(shè)置吸收波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)定D值。6個(gè)96孔板重復(fù)相同操作，分別于24、48、72 h各取出一個(gè)96孔板，每個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)5次，取平均值計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組D均值-空白組D均值)/(對(duì)照組D均值-空白組D均值)×100。

1.7 Western blot檢測(cè)STAT3和Bcl-2蛋白表達(dá)

將H9C2細(xì)胞接種在75 mm2細(xì)胞瓶中，加入15 mL含有10% FBS和1%雙抗的DMEM，置于含5% CO2的37.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)結(jié)果，選取DMSO和DMF體積分?jǐn)?shù)為0、0.2%、0.3%和0.5%加入75 mm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)72 h后，取出細(xì)胞瓶放于冰盒上，每75 mm2中加入1 mL細(xì)胞裂解液，置于含5% CO2的37.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3 min，加入含10% FBS終止消化，在方形冰盒上使用細(xì)胞刮充分刮下貼壁的細(xì)胞，吸取細(xì)胞裂解液加入無(wú)菌1.5 mL EP管中，放于冰盒上。收集蛋白完畢后，平衡EP管后放于離心機(jī)，12 000 r·min-1離心10 min，取上清加入無(wú)菌1.5 mL EP管中，按照5-1樣品體積加5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴7 min，取出樣品放于-80 ℃保存。檢測(cè)目的蛋白STAT3和Bcl-2，先進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，再半干轉(zhuǎn)膜，TBS洗滌3次，10 min一次，5% BSA封閉1 h，4 ℃分別孵育STAT3抗體和Bcl-2抗體(5% BSA分別稀釋抗體，比例均為1∶1 000)過(guò)夜，TBST充分洗滌3次，每次10 min，加入含辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(稀釋比1∶2 500)室溫振蕩1 h，TBST或TBS洗3次，每次10 min，將含目的蛋白的NC膜放入顯影儀，滴加顯影液(按照體積比1∶1配比)顯影，拍照記錄，以β-actin作為內(nèi)參，使用Image J圖像分析軟件分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05和P<0.01分別作為差異顯著性和差異極顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

觀察加入0.3% DMSO和DMF培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h后形態(tài)變化，細(xì)胞生長(zhǎng)較為緩慢，部分出現(xiàn)凋亡，形態(tài)短縮、不規(guī)則，細(xì)胞懸浮等變化。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在48 h和72 h細(xì)胞貼壁數(shù)量減少，空泡、懸浮細(xì)胞量增加。

A和a為對(duì)照組(不含DMSO和DMF)；B、C、D分別為0.3% DMSO對(duì)H9C2心肌細(xì)胞作用24、48、72 h的細(xì)胞形態(tài)圖(5×和10×顯微鏡)；b、c、d分別為0.3% DMF對(duì)H9C2心肌細(xì)胞作用24、48、72 h的細(xì)胞形態(tài)圖(5×和10×顯微鏡)。A and a were control group (without DMSO and DMF); B， C， D， 0.3% DMSO on H9C2 cardiomyocytes for 24， 48， 72 h cell morphology map (5 × and 10 × microscope); b， c， d， 0.3% DMF on H9C2 cardiomyocytes for 24， 48， 72 h cell morphology map (5× and 10× microscope).圖1 0.3% DMSO和DMF對(duì)H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)變化影響Fig.1 Effects of 0.3% DMSO and DMF on morphological changes of H9C2 cardiomyocytes

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率變化

H9C2心肌細(xì)胞在DMSO和DMF不同體積分?jǐn)?shù)作用下，通過(guò)MTT分別檢測(cè)24、48和72 h細(xì)胞存活率變化(表1和表2)，在DMSO和DMF體積分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，72 h對(duì)比48 h細(xì)胞存活率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降。

2.3 Western法測(cè)定DMSO和DMF不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)STAT3蛋白表達(dá)的影響

檢測(cè)DMSO和DMF作用H9C2心肌細(xì)胞72 h后，STAT3和Bcl-2的蛋白表達(dá)變化。如圖3所示，與對(duì)照組比較，DMSO和DMF體積分?jǐn)?shù)為0.3%和0.5%時(shí)，STAT3和Bcl-2蛋白的相對(duì)灰度值都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但DMF體積分?jǐn)?shù)為0.2%，STAT3有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Bcl-2無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.2%時(shí)，STAT3和Bcl-2與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1MTT法檢測(cè)DMSO對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響

Table1Effect of DMSO on myocardial cell survival rate by MTT assay

DMSO體積分?jǐn)?shù)Volume fractionof DMSO/%24 hD值D value存活率Survival rate/%48 hD值D value存活率Survival rate/%72 hD值D value存活率Survival rate/%00.618±0.010100.00±0.000.617±0.003100.00±0.3400.629±0.006100.00±0.5030.10.617±0.01099.56±1.530.604±0.01098.82±1.620.584±0.00997.91±1.050.20.601±0.05098.70±1.210.594±0.02198.28±1.200.573±0.01297.42±1.520.30.598±0.01195.76±1.50?0.576±0.00891.30±0.23?a0.538±0.00387.61±0.45?b0.50.587±0.01792.93±1.68?0.545±0.00686.33±0.81?a0.505±0.01080.29±1.09?b0.70.558±0.02590.22±1.21?0.520±0.00684.28±0.47?a0.477±0.00775.81±1.16?b0.90.543±0.01385.21±1.54?0.517±0.00478.20±0.69?a0.454±0.00471.27±0.58?b1.00.521±0.01079.44±0.078?0.503±0.00770.47±1.14?a0.426±0.00465.83±0.68?b2.00.453±0.01172.24±1.61?0.431±0.00464.75±0.68?a0.398±0.00755.32±0.99?b3.10.377±0.00861.00±1.30?0.355±0.00954.52±0.38?a0.309±0.00649.24±1.07?b

*，與對(duì)照組(不含DMSO)相比差異顯著，P<0.05；a，與24 h組相比差異顯著，P<0.05；b，與48 h組相比差異顯著，P<0.05。下同。

*， The significance compared with the control group (without DMSO)，P<0.05; a， The significance compared with the 24 h group，P<0.05; b， The significance compared with the 48 h group，P<0.05. The same as below.

表2MTT法檢測(cè)DMF對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響

Table2Effect of DMF on myocardial cell survival rate by MTT assay

DMF體積分?jǐn)?shù)Volume fractionof DMF/%24 hD值D value存活率Survival rate/%48 hD值D value存活率Survival rate/%72 hD值D value存活率Survival rate/%00.601±0.034100.00±0.000.597±0.013100.00±0.000.612±0.034100.00±0.000.10.599±0.02198.72±1.450.583±1.1498.45±1.120.579±1.3498.23±1.560.20.576±0.12098.11±1.320.557±0.24597.91±1.350.521±1.1397.34±0.780.30.546±0.23097.01±0.34?0.510±0.06794.47±0.67?a0.498±0.14592.02±0.21?b0.50.532±0.07896.13±0.63?0.496±0.34785.03±1.47?a0.475±0.08380.79±0.44?b0.70.512±0.13294.65±0.56?0.479±0.08981.46±0.68?a0.456±0.05874.54±0.43?b0.90.491±0.89184.45±0.64?0.453±0.07878.09±0.34?a0.424±0.08165.03±0.33?b1.00.458±0.03180.67±1.12?0.421±0.00874.54±0.39?a0.398±0.00663.43±0.51?b2.00.401±0.06270.34±0.43?0.379±0.05760.57±0.64?a0.356±0.01752.54±0.60?b3.00.345±0.07865.78±0.31?0.358±0.09755.76±1.06?a0.321±0.01349.01±0.52?b

A、B，不同DMSO與DMF體積分?jǐn)?shù)下STAT3和Bcl-2的Western blot結(jié)果圖；C、D、E、F分別為不同DMSO與DMF體積分?jǐn)?shù)下STAT3和Bcl-2的相對(duì)灰度值；**表示與對(duì)照組對(duì)比差異顯著(P<0.01)。A， B， The Western blot results of STAT3 and Bcl-2 with different volume fraction of DMSO and DMF; C， D， E， F were the relative gray values of STAT3 and Bcl-2 with different volume fraction of DMSO and DMF；**， the significance compared with the control group (P<0.01).圖2 STAT3和Bcl-2相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.2 Changes of relative expression of STAT3 and Bcl-2

3 討論

DMSO和DMF常被用作生物研究中的溶劑和藥物治療的載體，可與多種有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)完全混合，應(yīng)用于治療疾病和科學(xué)試驗(yàn)研究中，對(duì)不同細(xì)胞的毒性作用不可被忽略。有研究報(bào)道，DMSO對(duì)血液系統(tǒng)、兔視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞等具有毒性作用，高濃度影響外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)增殖和細(xì)胞因子分泌，在低濃度下降低T淋巴細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞因子的分泌[7-11]，但體外試驗(yàn)DMSO為0.1%～0.8%時(shí)作用大鼠心肌細(xì)胞6 h，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，抗氧化損傷作用機(jī)制與OH-1表達(dá)上調(diào)有關(guān)[12]，推測(cè)DMSO對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有治療作用，體內(nèi)試驗(yàn)卻驗(yàn)證DMSO對(duì)腦死亡的大鼠心肌細(xì)胞無(wú)治療作用，腦死亡(BD)所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡作用機(jī)制與JNK信號(hào)通路的激活通過(guò)線粒體通路介導(dǎo)相關(guān)，線粒體凋亡通路受Bcl-2、caspase-3、Bax、Cyt-c蛋白影響[13]。DMF對(duì)消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等具有損傷作用，主要通過(guò)皮膚和呼吸道感染。體外試驗(yàn)DMSO對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎性損傷作用，受活性氧和NF-κB調(diào)控[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMSO和DMF對(duì)H9C2心肌細(xì)胞具有不同程度的毒性作用，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著體積分?jǐn)?shù)增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，Bcl-2和STAT3蛋白表達(dá)均有下調(diào)，但當(dāng)DMSO和DMF體積分?jǐn)?shù)增加至0.5%時(shí)，STAT3表達(dá)上調(diào)，推測(cè)與機(jī)體平衡自身穩(wěn)態(tài)相關(guān)，提示Bcl-2與STAT3蛋白可能共同調(diào)控DMSO和DMF對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

Bcl-2家族分為抗凋亡和促凋亡蛋白?？沟蛲龅鞍譈cl-2在線粒體介導(dǎo)的凋亡中起著重要的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)表達(dá)上調(diào)，抵抗細(xì)胞凋亡損傷，癌細(xì)胞常常依賴(lài)Bcl-2來(lái)保護(hù)自己不受凋亡的影響。眾所周知，Bcl-2蛋白的分布是一個(gè)決定細(xì)胞命運(yùn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。Bcl-2存在于線粒體、平滑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、高爾基體、過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞核中。Bcl-2主要定位于線粒體外膜，可抑制程序性細(xì)胞死亡，通過(guò)控制線粒體外膜通透性(MOMP)，在線粒體中保留細(xì)胞色素C，抵抗細(xì)胞凋亡損傷[15]。Bcl-2蛋白的過(guò)度表達(dá)可以抑制Bax和Bak的激活，阻止細(xì)胞色素C的釋放和caspase的激活共同改變細(xì)胞凋亡[16]。Bcl-2可抑制程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞淋巴瘤-2(bcl-2)家族的蛋白決定細(xì)胞的生命和線粒體自殺程序的凋亡，在程序性細(xì)胞死亡中，線粒體凋亡可能是最常見(jiàn)的形式，主要是去除多余的、感染的或受損的細(xì)胞[17]。線粒體是心肌細(xì)胞主要的能量供應(yīng)，DMSO和DMF作用心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，心肌細(xì)胞線粒體發(fā)生凋亡，細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和自噬等重要細(xì)胞過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子[18]。STAT3在幾種實(shí)體癌和血液病中的一個(gè)或兩個(gè)殘基中被組成性磷酸化，活化的STAT3從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與特定的啟動(dòng)子序列結(jié)合，然后調(diào)節(jié)抗凋亡和細(xì)胞周期，調(diào)控基因產(chǎn)物(如Bcl-2、XIAP和cyclinD1)的轉(zhuǎn)錄激活，發(fā)揮抗凋亡作用[19-20]。DMSO和DMF可能通過(guò)降低心肌細(xì)胞STAT3發(fā)生磷酸化，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，使細(xì)胞存活率下降。