秦 振，董 楠，楊 林，廖巖峰

(天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

林可霉素(lincomycin)(圖1)[1]是一種高效廣譜抗生素，于1962年由美國人Mason等首先從鏈霉菌林可變種培養(yǎng)液中獲得，從此獲得廣泛應(yīng)用。林可霉素分子式為C18H34N2O6S，相對分子質(zhì)量為406.56。

圖1 林可霉素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Lincomycin structural formula

目前在世界上發(fā)酵培養(yǎng)是抗生素生產(chǎn)的主要方法，各國都在廣泛應(yīng)用。由于在發(fā)酵液中存在著大量菌絲體的同時，還存在著菌體的代謝物，剩余培養(yǎng)基以及抗生素主組分以外的其它復(fù)雜組分。所以，在抗生素提取精制之前，必須進行預(yù)處理、過濾，以除去這些干擾物質(zhì)[3-4]。

目前對于發(fā)酵液的處理方法，有帶菌絲體萃取、雙水相法、樹脂離子交換法、膜分離以及板框過濾法等，以上各種方法都各有優(yōu)缺點。板框過濾法因其技術(shù)要求簡單，操作簡便因此被我公司采用。

發(fā)酵液在過濾前需要進行預(yù)處理。通過預(yù)處理改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)以利于固液分離。預(yù)處理常用的方法有pH、溫度調(diào)節(jié)、絮凝等。對于不同的抗生素產(chǎn)品其預(yù)處理的具體主法不同。本文主要以林可霉素為例，對發(fā)酵液的預(yù)處理方法和效果進行研究。

1 實驗方法

1.1 pH值調(diào)節(jié)的影響

常溫下取林可霉素發(fā)酵液，升至適當溫度后用草酸將發(fā)酵液調(diào)至適當pH值，測定濾速(mL·5min-1)。取數(shù)份體積相同的預(yù)處理(pH值為2.8)，將其回調(diào)到不同的pH值，攪拌均勻后用濾紙過濾，分別測定各濾液效價和濾速。

1.2 溫度調(diào)節(jié)的影響

取林可霉素發(fā)酵液，加入草酸將pH值調(diào)至2.8后，接著加入適量的硫酸鋅和黃血鹽，最后在不同的溫度下過濾，分別測定各濾液效價和濾速。

1.3 外加物質(zhì)的影響

取林可霉素發(fā)酵液，加入不同含量的硫酸鋅和黃血鹽，攪拌30 min后過濾，測定濾液效價、蛋白質(zhì)含量(以沉淀物計算)和過濾速度。

以上實驗所用的林可霉素發(fā)酵液由天方藥業(yè)有限公司林可生產(chǎn)車間提供。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 預(yù)處理pH值對過濾的影響

在水溶液中抗生素存在著解離平衡，pH值的高低影響著解離平衡。取林可霉素發(fā)酵液分別調(diào)到不同的pH值(pH值=2～8)，測定濾液效價的不同變化。

實驗結(jié)果見圖1。通過對比實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同的pH值下過濾后的林可霉素發(fā)酵液效價存在峰值。同時在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，pH值對林可霉素發(fā)酵液的濾速、蛋白質(zhì)含量的影響都比較大。在pH值<3.5時過濾后蛋白質(zhì)的析出量較多，最大可達到110 mg(10 mL濾液)-1(見表1)，說明在過濾過程中較低的pH值使濾液中堿性蛋白質(zhì)的析出量增加。

圖1 林可霉素濾液效價與pH的關(guān)系圖Fig.1 Lincomycin filtrate titers and pH relationship diagram

表1 pH值對濾速與蛋白質(zhì)含量影響Table 1 pH on the filtration rate and protein content

為了研究pH值<3.0時效價降低現(xiàn)象及過濾pH值對后續(xù)萃取過程的影響。在接下來又做了對pH回調(diào)后對濾液的影響實驗：取林可霉素發(fā)酵液先調(diào)節(jié)pH值至3.0，然后再分別回調(diào)至pH值=3.0～7.5，測定濾液效價變化(見圖2)。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著pH值回調(diào)不斷的上升，濾液效價呈下降趨勢，其具體表現(xiàn)與圖1相似，但是濾液的濾速變化小，蛋白質(zhì)的析出量逐漸減小，并趨于一定值(見表2)。

圖2 pH值回調(diào)后對效價的影響Fig.2 pH callback on the impact of price

從以上實驗我們可以看出，濾液的效價只與最終的pH值有關(guān)，同實驗過程中的pH調(diào)節(jié)關(guān)系不大， 這說明林可霉素濃度與pH值之間存在著一定的平衡關(guān)系，林可霉素在溶液和固形物之間存在著一種吸附平衡。發(fā)酵液中存在著多種蛋白質(zhì)，不同的等電點下蛋白質(zhì)的含量差異比較大，林可霉素是在偏酸性的條件下進行過濾，此時基本上不會析出堿性的蛋白質(zhì)。當pH值上調(diào)到9.5左右時蛋白質(zhì)會大量析出，此時易造成乳化現(xiàn)象，使分相出現(xiàn)困難。蛋白質(zhì)在溶液中存在著溶解平衡和變性問題，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的影響因素較多，計算比料復(fù)雜，通過實驗發(fā)現(xiàn)，過濾時如果pH值高于6.5濾液中的堿性蛋白質(zhì)的含量會比較少。

表2 pH對濾速與蛋白質(zhì)含量影響Table 2 pH on the filtration rate and protein content

2.2 溫度調(diào)節(jié)的影響

林可霉素發(fā)酵液過濾速率受溫度的影響，因此我們做了溫度對發(fā)酵液過濾速度的影響實驗，取放罐發(fā)酵液分別調(diào)節(jié)溫度(30～80℃)，測定濾液效價及濾速的變化。實驗結(jié)果見圖3。實驗發(fā)現(xiàn)，過濾林可霉素發(fā)酵液時溫度越高濾速越高，但濾液效價隨著溫度的升高而降低。通過實驗我們可以發(fā)現(xiàn)，溫度對發(fā)酵液的濾速和效價影響都非常的大。

從圖3我們可以看出隨著溫度不斷的提高，發(fā)酵液效價隨著降低，但是發(fā)酵液的濾速卻不斷提高，然而隨著溫度再進一步的升高，濾速會趨于一穩(wěn)定值。

2.3 外加物質(zhì)的影響

圖4 外加物質(zhì)對濾速、效價和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of added substances on filtration rate,titer and protein content

在恒定溫度和pH值的條件下加入不同量的外加物質(zhì)(黃血鹽和硫酸鋅1∶1配比)，測定林可霉素發(fā)酵液效價和濾速。實驗結(jié)果見圖4。實驗發(fā)現(xiàn)，在林可霉素發(fā)酵液中加入不同量的黃血鹽和硫酸鋅對林可霉素效價影響不大，但對蛋白質(zhì)含量和發(fā)酵液濾速的影響較大。

由圖4可看出，隨著外加物質(zhì)濃度的增加，林可霉素效價基本維持在一穩(wěn)定值，說明外加物質(zhì)的加入對效價影響不大；但發(fā)酵液的濾速則不斷提高，最后趨于一穩(wěn)定值，說明外加物質(zhì)的加入可提高發(fā)酵液的濾速；而外加物質(zhì)增加則可降低蛋白質(zhì)含量，但在生產(chǎn)中需考慮生產(chǎn)成本問題，所以外加物質(zhì)可控制在0.15%～0.3%最佳。

2.4 染菌對提取的影響

林可霉素提取的影響因素除了pH值、溫度和外加物質(zhì)外，染菌對提取的影響也非常的大。

2.4.1 對過濾的影響

發(fā)酵罐因染雜菌后，發(fā)酵液黏度加大，造成提取板框過濾時間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用；因為黏度大，濾渣殘留量也加大，破壞生產(chǎn)平衡，且降低過過濾收率。

2.4.2 對有機溶劑萃取的影響

染菌的發(fā)酵液含有大量的水溶性蛋白質(zhì)，更易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開。

2.4.3 對離子交換的影響

雜菌會粘在樹脂表面或被樹脂吸附，從而降低離子交換樹脂的交換性能。

2.4.4 對產(chǎn)品質(zhì)量的影響

如果染菌會造成發(fā)酵液中出現(xiàn)較多的蛋白質(zhì)和其他的雜質(zhì)，會對產(chǎn)品的純度造成較大的影響；同時可能會產(chǎn)品的外觀造成影響。

2.4.5 雜菌對“三廢”處理的影響

染菌后的發(fā)酵廢液，生物好氧量(COD)增高，增加三廢治理時間和成本。

2.5 提高異常發(fā)酵罐產(chǎn)品質(zhì)量的方法

(1)針對異常發(fā)酵罐放罐發(fā)酵液要多做小試，找到黃血鹽與草酸兩種物料的比例。

(2)在生產(chǎn)投料時，要分多次加入，且每次都要做小試，盡量找到最佳點。

2.6 降低藥渣殘留的方法

(1)濾液過濾時不能使板框的壓力過高，壓力控制在0.2～0.25 MPa，便于洗水。

(2)對各級板框之間的壓力也要做出調(diào)整，壓力控制在0.2～0.25 MPa，并注意末尾板框壓力。

3 結(jié)論

(1)在抗生素的發(fā)酵液中存在著電離平衡，同時在發(fā)酵液中固形物和蛋白質(zhì)在沉淀過程中也會存在吸附平衡，各種預(yù)處理方法都會對上述平衡造成一定的影響。

(2)由于蛋白質(zhì)在不溶液中存在著變性和溶解平衡，采用不同的溫度和pH濾液中的蛋白質(zhì)含量和濾速會出現(xiàn)不同。

(3)染菌不僅僅對發(fā)酵效價影響較大，對后面提取的收率和產(chǎn)品質(zhì)量影響也很大，降低染菌率可以提高收率和產(chǎn)品質(zhì)量。