朱筱慧 賈嫚 許家艷 孟亞奇 喬瑩瑩 姚欣

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科210029;2蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科,常州213003

COPD是一種常見的可以預(yù)防和治療的疾病,以持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限為特征[1]。過去學(xué)者們認(rèn)為COPD是慢性炎癥性疾病,而近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化/抗氧化失衡等非炎癥機(jī)制,亦是造成COPD氣道重塑及氣流不可逆受限的重要原因[2-3]。1964年,瑞典學(xué)者Laurell和Eriksson率先提出了蛋白酶/抗蛋白酶失衡假說,該假說目前已成為肺氣腫發(fā)病的經(jīng)典機(jī)制[4]。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)是1991年由Kirchhoff等[5]在男性附睪組織中發(fā)現(xiàn)的,與分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(secretory leucocyte protease inhibitor,SLPI)和彈性蛋白酶抑制劑elafin具備同源性,均屬于乳清酸性蛋白(whey acid proteim,WAP)抑制劑家族成員之一,后兩者在多個系統(tǒng)均表現(xiàn)出一定的抗蛋白酶活性[6]。該家族成員可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等多種蛋白酶的活性從而保護(hù)肺組織,減輕肺組織的損傷。本研究通過檢測穩(wěn)定期COPD患者肺組織、造模小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)以及人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells,16 HBE)HE4的表達(dá)水平,探索HE4與COPD的聯(lián)系。

1 對象與方法

1.1人肺組織 本實驗中研究對象肺組織由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科提供。肺組織來源于因肺結(jié)節(jié)、肺大泡、肺癌等相關(guān)肺部疾病接受手術(shù)治療的患者,若為肺部惡性腫瘤患者,肺組織則取自腫瘤病灶邊緣5 cm 以外的范圍。根據(jù)獲得的肺組織患者的第一秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in the first second,FEV1)/FVC參數(shù)分為COPD組6 例(FEV1/FVC＜70%)、對 照 組6 例(FEV1/FVC ≥70%)[1]。以上所有研究對象均對此實驗有所知曉并同意進(jìn)行,均簽署了知情同意書。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(2018-SRFA-205)。

1.2動物及細(xì)胞來源 6周C57BL/6 雄性小鼠,獲取于南京江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0001;16 HBE 獲取于美國模式菌種收集中心。

1.3材料 香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE,美國Philip Morris公司),HE4抗體(美國Fab Gennix 公司),小鼠HE4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)Kit(中國華美公司),16 HBE(美國ATCC公司),1640 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司),胎牛血清(美國Sciencecell公司)。引物由南京銳真生物公司生產(chǎn),HE4引物序列：上游引物為5'-CAAGAGTGCGTCTCGGACAG-3';下游引物為5'-TTCATCTGGCCAGGACACTG-3',甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物序列：上游引物為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3';下游引物為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.4方法

1.4.1人肺組織免疫組織化學(xué) 首先,取得肺組織標(biāo)本后,先用無菌的冰生理鹽水反復(fù)沖洗肺組織去除標(biāo)本上手術(shù)時殘留的血液;其次,將肺組織完全浸沒于4%的甲醛溶液中固定,并過夜;然后,石蠟塊包埋,切成0.4 mm 厚的切片,烘片。HE染色,放置于光學(xué)顯微鏡下觀察人肺組織的病理變化。免疫組織化學(xué)檢測人肺組織HE4 蛋白表達(dá),具體步驟如下：枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù)、3%H2O2室溫,均15 min,PBS溶液洗滌3次;山羊血清工作液37℃孵育1 h,加一抗(HE4抗體1∶200)過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗(山羊抗鼠1∶2 000)37℃孵育1 h,TBS 緩沖液洗滌3 次;DAB顯色,自來水終止顯色;蘇木精染色2 min;蒸餾水沖洗,鹽酸酒精分化并水洗,45℃溫水返藍(lán)10 min;中性樹脂片封片并鏡檢。采用Image-pro plus 7.0軟件分析免疫組織化學(xué)切片：每組切片分別隨機(jī)挑選5個200倍、400倍視野進(jìn)行觀察并拍照。胞質(zhì)棕黃色為HE4染色陽性,測量HE4陽性的積分光密度值(integral optical density,IOD),計算IOD/area。

1.4.2動物造模 采用隨機(jī)教學(xué)表法將24只6周C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對照組和COPD組,每組12只。COPD組暴露于3 ppm 的臭氧,每周2次,每次3 h[7];對照組在相同條件下暴露于空氣。分別于實驗開始后1 周、3 周末次暴露24 h后,2組各取6 只小鼠處死取材。將小鼠右肺結(jié)扎,用1 ml注射器緩慢推入0.4 ml預(yù)冷的1×PBS至氣管,30 s后緩慢回抽,將獲得的左肺BALF放入EP管中。4℃,離心半徑8 cm,1 500 r/min離心10 min,保存于-80℃冰箱。采用ELISA 檢測臭氧造模小鼠BALF中HE4的濃度,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4.3細(xì)胞實驗 分別用1%、2.5%、5%濃度的CSE預(yù)處理16 HBE細(xì)胞24 h,以無任何干預(yù)措施的細(xì)胞為對照組。移去培養(yǎng)基,以預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞,每孔加入1 ml Trizol提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后加入SYBR Green行實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s→變性95℃5 s→退火60℃30 s→延伸72℃10 min,共40個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計量資料以±s表示,組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基本臨床資料 2 組年齡、性別組成比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05),COPD組FEV1、FEV1%pred、FVC 及FEV1/FVC 均低于對照組(P值均＜0.05),見表1。

2.2人肺組織中HE4 免疫組織化學(xué)染色及半定量 HE4主要分布于支氣管上皮細(xì)胞,肺泡巨噬細(xì)胞也有少量表達(dá)(圖1)。以IOD 值對HE4表達(dá)進(jìn)行半定量分析,對照組肺組織HE4表達(dá)量為0.070±0.007,COPD組肺組織HE4 表達(dá)量為0.048±0.004,COPD組HE4 表達(dá)量低于對照組(t=2.267,P＜0.05),見圖2。

圖1 人肺組織中人附睪蛋白4病理圖片 免疫組織化學(xué)染色 ×400 A：對照組;B：COPD組

2.3COPD小鼠模型制備結(jié)果 對照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整,無肺泡擴(kuò)大;COPD組可見肺組織稀疏,肺泡隔減少、破壞,肺泡壁斷裂,肺泡擴(kuò)大、融合,肺大泡形成(圖3),1周、3周時2組小鼠肺泡平均線性截距比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＜0.000 1),見圖4。除了肺氣腫表現(xiàn),COPD組還出現(xiàn)了氣道壁增厚及炎癥細(xì)胞浸潤,表明造模成功。

表1 臨床病例基本資料

圖2 2組肺組織支氣管上皮細(xì)胞中人附睪蛋白4表達(dá)水平

圖3 2組小鼠肺組織病理學(xué)改變 HE ×200

圖4 2組小鼠肺泡平均線性截距情況

2.4HE4在BALF中表達(dá)情況 1周時,對照組小鼠BALF中HE4水平為(838.5±110.2)ng/L,COPD組為(463.1±107.0)ng/L;3周時,對照組小鼠BALF中HE4水平為(760.6±138.0)ng/L,COPD組為(403.4±52.27)ng/L。在1周、3周時,COPD組小鼠BALF中HE4水平均低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.423、2.987,P值均＜0.05),見圖5。

2.5HE4 m RNA 在CSE預(yù)處理16HBE中表達(dá)情況 與對照組比較,2.5%、5%CSE 干預(yù)細(xì)胞均明顯抑制HE4 m RNA 的相對表達(dá)量,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.895、4.060,P值均＜0.05),見圖6。

圖5 2組小鼠支氣管肺泡灌洗液中人附睪蛋白4情況

圖6 各組人支氣管上皮細(xì)胞中人附睪蛋白4 m RNA 表達(dá)情況

3 討論

COPD是目前世界范圍內(nèi)一個主要的公共衛(wèi)生問題[1],發(fā)病率和病死率日益增長。學(xué)者預(yù)測,到2020年,因COPD導(dǎo)致的病死率將會升至全球第三位[8]。盡管COPD近年來受到醫(yī)學(xué)界的極大關(guān)注,但它的確切發(fā)病機(jī)制仍然尚未完全揭曉[8]。COPD被認(rèn)為是長期累積暴露于有毒氣體和顆粒等環(huán)境因素及包括遺傳學(xué)、氣道高反應(yīng)性和兒童期肺部生長不良等多種宿主因素的后果[8-9]。

HE4基因又稱為WAP-4-二硫化物核心結(jié)構(gòu)域2,定位在染色體20 q12-q13.1,由WAP類型的二硫鍵核心構(gòu)成,編碼124個氨基酸的HE4蛋白前體,全長11.78 kb[10]。HE4分布于人體一些組織和器官,如：氣管、呼吸道上皮細(xì)胞、唾液腺、腸道黏膜、遠(yuǎn)端腎小管、前列腺、附睪等;HE4 亦存在于一些惡性腫瘤組織中,如：婦科系統(tǒng)的子宮內(nèi)膜癌、卵巢漿液性癌以及肺癌等[10]。

Bingle等[11]通過免疫組織化學(xué)的方法闡明了HE4在呼吸道、唾液腺、外周肺組織的表達(dá)部位,并發(fā)現(xiàn)其在囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)患者的支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)升高。Nagy等[12]學(xué)者發(fā)現(xiàn),在囊性纖維化患者中,血清HE4水平與其整體病情嚴(yán)重性及肺功能下降速度呈明顯正相關(guān),推測HE4可作為CF 的新炎癥因子并可用作評估CF治療療效。LeBleu 等[13]發(fā)現(xiàn),HE4 基因作為假定的絲氨酸蛋白酶抑制劑在人和小鼠腎纖維化模型中表達(dá)均上調(diào),并且在腎纖維化患者血清中的濃度升高,對基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶均有抑制作用,與其自身的類絲氨酸蛋白酶抑制劑活性密切相關(guān)。在COPD領(lǐng)域,目前尚無與HE4 相關(guān)的研究發(fā)表。COPD患者存在遷延不愈的持久的氣道慢性炎癥,即使徹底戒煙后,這種氣道炎癥仍然持續(xù)存在,相關(guān)具體機(jī)制尚不明確,導(dǎo)致氣管、支氣管以及黏膜下腺體中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌增多,并且募集、活化,造成氣道內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈力酶等蛋白酶成分的釋放顯著增多,蛋白酶占據(jù)絕對優(yōu)勢,從而出現(xiàn)彈性蛋白降解,肺間質(zhì)消融,肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔擴(kuò)大和/或融合,小氣道在呼氣末失去了周圍肺組織的支持而塌陷,導(dǎo)致COPD發(fā)生、發(fā)展[4]。另外,COPD患者氣道上皮發(fā)生杯狀細(xì)胞的增生、促炎癥介質(zhì)的釋放等一系列病理生理學(xué)改變,通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),引起間質(zhì)標(biāo)記物如成纖維細(xì)胞蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶9等表達(dá)增高,從而產(chǎn)生氣道重塑[14]。因此,我們推測,HE4可能與COPD的氣道炎癥和/或氣道重塑存在一定的相關(guān)性。本項研究顯示,在COPD組患者肺組織中,HE4主要在支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá),同時在肺泡巨噬細(xì)胞中亦有極少量表達(dá);COPD組小鼠BALF中HE4水平降低,推測HE4所具有的抗蛋白酶活性,可與基質(zhì)金屬蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈力酶等蛋白酶相結(jié)合,抑制彈性蛋白降解,減輕肺組織損傷,因此支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)游離的HE4消耗相應(yīng)增多從而導(dǎo)致含量減少,該機(jī)制可能是HE4下降的主要機(jī)制之一。

煙霧暴露是COPD的重要的危險因素,16HBE受CSE刺激后,HE4表達(dá)水平下降,表明支氣管上皮細(xì)胞中HE4水平的降低可能與CSE 等有毒有害氣體對氣道屏障的損害作用有關(guān),但具體的信號通路尚待研究。Small 等[15]發(fā)現(xiàn),作為WAP抑制劑家族成員中研究最多的蛋白質(zhì),SLPI是氣道中重要的保護(hù)基質(zhì),SLPI進(jìn)入巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞的細(xì)胞核,通過調(diào)節(jié)核因子κB 通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),其與P65競爭性結(jié)合核因子κB 的連接位點(diǎn),從而抑制炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,如：腫瘤壞死因子α和IL-8,從而減輕炎癥反應(yīng)。既往研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)被 認(rèn) 定是COPD發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的致病因子,牛瑞超等[16]研究表明,COPD大鼠模型肺組織標(biāo)本中SLPI的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下降趨勢,有可能歸結(jié)于TGF-β1表達(dá)量上升;同時發(fā)現(xiàn),TGF-β1使COPD大鼠模型支氣管上皮細(xì)胞中SLPI表達(dá)下降是通過Smads信號通路介導(dǎo)的。我們猜測,HE4與SLPI同為WAP基因家族成員,可能作用機(jī)制相同,均是通過調(diào)節(jié)核因子κB 和/或TGF-β1/Smads信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能。

目前,在COPD領(lǐng)域尚無與HE4相關(guān)的研究發(fā)表。鑒于WFDC 家族蛋白質(zhì)具有豐富的生物學(xué)效應(yīng),HE4作為功能多樣的分泌蛋白,在COPD的病程中可能具備重要的生物學(xué)特性。HE4具備蛋白酶抑制劑的功能[13],由此,我們猜測HE4通過調(diào)節(jié)蛋白酶/抗蛋白酶失衡機(jī)制對COPD病程產(chǎn)生影響,COPD支氣管上皮細(xì)胞HE4表達(dá)量降低可能因其消耗過多所導(dǎo)致。反之,通過重組蛋白提高支氣管上皮細(xì)胞中HE4水平,可能抑制彈性蛋白降解,減慢COPD發(fā)生、發(fā)展。本研究目前存在一定的局限性,雖然HE4在COPD支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)水平降低,但具體機(jī)制尚未完全闡明,本課題組下一步將會對此進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述,HE4可能是COPD發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在生物標(biāo)志物,對HE4作用機(jī)制的進(jìn)一步研究將可能對COPD產(chǎn)生影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突