黃超文　趙強　鐘雪鶯　溫玉婷　梁麗萍　黃炎明

【摘要】 目的：探討干擾16HBE細(xì)胞中S100A4基因表達后，HDM（屋塵螨）誘導(dǎo)的氣道上皮屏障功能和信號蛋白的變化。方法：合成靶向S100A4基因的siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染正常16HBE細(xì)胞，PCR和Western blot檢測干擾效果，并使用HDM刺激正常和干擾后的16HBE細(xì)胞，檢測跨細(xì)胞電阻、FITC通透性，以及屏障蛋白（E-cadherin、β-catenin）、下游信號分子VEGFR2/p-VEGFR2表達的變化。結(jié)果：siRNA干擾后成功抑制16HBE細(xì)胞的S100A4基因和蛋白表達。HDM引起正常16HBE細(xì)胞TEER減少和FITC通透性增加，干擾S100A4可抑制HDM對跨細(xì)胞電阻和FITC通透性的損害。HDM刺激導(dǎo)致E-cadherin、β-catenin表達下調(diào)，干擾S100A4可減輕HDM對16HBE細(xì)胞屏障蛋白的破壞。HDM刺激后引起培養(yǎng)液中S100A4釋放增加，細(xì)胞p-VEGFR2表達顯著增加，而siRNA干擾后的16HBE細(xì)胞p-VEGFR2的表達僅輕度增加。結(jié)論：S100A4在HDM誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞屏障損害中具有重要作用，可為哮喘的防治提供重要科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 哮喘; S100家族鈣結(jié)合蛋白A4; 屋塵螨提取物; 上皮細(xì)胞屏障; 血管生成因子

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.20.001 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2019）20-000-04

Role of Interfering S100A4 in HDM Induced Airway Epithelial Barrier Dysfunction/HUANG Chaowen，ZHAO Qiang，ZHONG Xueying，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（20）：-4

【Abstract】 Objective：To investigate the changes of airway epithelial barrier function and signaling proteins in asthma induced by HDM after RNAi with S100A4 gene expression in 16HBE cells.Method：16HBE were transfected by S100A4 siRNA，the interference effect was detected by PCR and Western blot.16HBE were stimulated by HDM.The changes of TEER，F(xiàn)ITC permeability，barrier proteins and VEGFR2/p-VEGFR2 were detected.Result：S100A4 gene and protein in 16HBE cells was inhibited successfully by siRNA interference.HDM stimulation resulted in decrease of TEER and increase of FITC permeability in normal 16HBE.S100A4 RNAi ameliorated the impairment of HDM on TEER and FITC permeability.The expression of E-cadherin and β-catenin was down-regulated by HDM stimulation，while interference with S100A4 could alleviate the damage of barrier proteins induced by HDM.HDM promoted the release of S100A4 in culture medium and profoundly elevated the expression of p-VEGFR2 in normal cells，while the expression of p-VEGFR2 in RNAi 16HBE slightly increased.Conclusion：S100A4 plays an important role in HDM-induced airway epithelial barrier dysfunction，and these findings can provide scientific basis for the prevention and treatment of asthma.

【Key words】 Asthma; S100A4; House dust mite extract; Airway epithelial barrier; Vascular endothelial growth factor

First-authors address：Jiangmen Central Hospital，Jiangmen 529000，China

我國哮喘發(fā)病率在逐年增高，雖低于發(fā)達國家，但死亡率卻高居世界之首，而發(fā)病機制尚未明確。氣道上皮是肺抵御外界刺激的第一道防線，氣道上皮屏障功能破壞是哮喘發(fā)病的首要環(huán)節(jié)[1-2]。上皮細(xì)胞屏障蛋白破壞后引起更多過敏原和刺激物進入上皮下，從而加重氣道炎癥，并可直接激活下游信號通路，最終引起慢性氣道炎癥、平滑肌增生和氣道

重塑[3]。

S100A4蛋白屬于鈣離子結(jié)合蛋白家族中最大亞家族S100家族的成員，目前關(guān)于S100A4蛋白的研究主要聚焦在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但S100A4蛋白在炎癥中同樣發(fā)揮巨大作用。S100A4可調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能，在細(xì)胞增殖、分化、肌肉收縮和凋亡中發(fā)揮重要作用[4-5]。新近研究認(rèn)為，S100A4蛋白不僅存在于細(xì)胞中，而且可以通過外泌體的形式主動分泌到細(xì)胞間，發(fā)揮與細(xì)胞內(nèi)不同的生物學(xué)效應(yīng)[6-7]。本研究擬通過干擾16HBE細(xì)胞S100A4基因表達，評價S100A4蛋白在HDM（屋塵螨）誘導(dǎo)的哮喘氣道上皮屏障功能破壞中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人正常氣道上皮細(xì)胞16HBE細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供）在培養(yǎng)瓶中生長密度達90%左右時，胰酶[吉諾生物科技有限公司（中國）提供]消化后移至6孔板中，分為空白對照組（無轉(zhuǎn)染，con組）、轉(zhuǎn)染空白序列組（NC組），S100A4干擾組（轉(zhuǎn)染S100A4序列，S100A4-siRNA組）。

1.2 方法

（1）各組均進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，S100A4干擾堿基序列及陰性對照干擾序列由美國Ambion公司提供[8]，正義鏈：5 GGACAAGGCCCGUUAUGAA dTdT 3，反義鏈：3 dTdT CCUGUUCCGGGCAAUACUU 5，等細(xì)胞生長至整個板表面積60%左右時進行轉(zhuǎn)染。Lipofectamine TM2000（美國Thermo scientific公司）5 μl+無血清的RPMI（美國GIBCO公司）245 μl混勻稀釋，室溫孵育5 min，再取S100A4-siRNA或陰性對照siRNA序列75 pmol（250 μl），加入上述稀釋液中等混勻，室溫孵育20 min，按照500 μl/孔分組加到6孔板內(nèi)，混勻;37 ℃?5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h收取細(xì)胞，進行檢測和下一步實驗。

（2）陰性對照siRNA細(xì)胞和S100A4-siRNA細(xì)胞生長達整個板表面積80%時，分別使用PBS（1 ml，預(yù)處理24 h）、HDM（400 U：

1 ml，預(yù)處理24 h，丹麥ALK公司）處理上述兩種細(xì)胞。實驗共分成4組，正常組（PBS+NC組），HDM刺激陰性對照siRNA細(xì)胞組（HDM+NC組），PBS刺激S100A4-siRNA細(xì)胞組（PBS+siRNA組），HDM刺激S100A4-siRNA細(xì)胞組（HDM+siRNA組）。TEER用Millicell電阻儀（美國Millipore公司）進行測定，求得標(biāo)準(zhǔn)化電阻值。檢測細(xì)胞跨膜電阻（TEER）和異硫氰酸熒光素-右旋糖酐（美國Sigma公司）透過率（FITC-Dextran）評價屏障的直接功能;FITC-Dextran用于研究單層細(xì)胞通透性的變化;收集刺激后細(xì)胞的培養(yǎng)液，超濾后檢測分泌型S00A4總量;Western blot檢測屏障蛋白E-cadherin（美國CST公司）、β-catenin（美國CST公司）和VEGFR2（美國Abcam公司）、p-VEGFR2（美國Abcam公司）。

1.3 檢測指標(biāo)

（1）RTPCR、Western Blot分別檢測各組細(xì)胞S100A4基因mRNA和蛋白表達情況，以評價干擾效果;（2）檢測細(xì)胞跨膜電阻（TEER）和異硫氰酸熒光素-右旋糖酐透過率（FITC-Dextran）評價屏障的直接功能;（3）FITC-Dextran實驗結(jié)果均以Pa/對照組Pa（Pc）×100%表示;（4）對比各組S00A4總量;（5）對比各組E-cadherin、β-catenin和VEGFR2、p-VEGFR2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計量資料使用（x±s）表示，均數(shù)滿足方差齊性時采用單向方差分析（one way ANOVA），組間多重比較采用Bonferroni法比較;不滿足方差齊性時均數(shù)比較采用Welch法比較，組間多重比較采用Tamhanes T2檢驗比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A4干擾效果比較

NC組的S100A4基因表達對比con組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但S00A4-siRNA組對比con組、NC組的S100A4 mRNA表達均明顯低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1、圖1-A。Western Blot結(jié)果顯示NC組S100A4蛋白表達與con組基本相同，但S00A4-siRNA組蛋白表達顯著減少（表1、圖1-B、圖1-C）。

2.2 干擾S100A4在HDM介導(dǎo)的16HBE屏障功能破壞的作用對比

HDM刺激NC細(xì)胞導(dǎo)致TEER下降和FITC-Dextran增加，對比PBS+NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2、圖2。而HDM刺激S00A4-siRNA細(xì)胞僅引起TEER輕度下降及FITC-Dextran輕度增加，對比HDM刺激的NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2、圖2。

2.3 HDM對NC和S100A4-siRNA細(xì)胞屏障蛋白和VEGFR2的影響比較

HDM刺激NC細(xì)胞可導(dǎo)致屏障蛋白E-cadherin和β-catenin表達減少，并促使VEGFR2的磷酸化，但不影響總VEGFR2的表達，此結(jié)果與本文作者既往研究結(jié)果文獻[9]相一致。而對比NC組，HDM刺激S100A4-siRNA細(xì)胞所致的屏障蛋白破壞和VEGFR2的磷酸化均明顯受到抑制。同時，HDM刺激S100A4-siRNA細(xì)胞雖可引起分泌型S100A4輕度增高，但仍顯著低于NC組的分泌量（表3、圖3）。

3 討論

目前哮喘的發(fā)病機制尚未明確，而氣道上皮屏障功能破壞是哮喘發(fā)病的啟動環(huán)節(jié)。筆者的前期研究結(jié)果顯示：VEGFR2磷酸化在HDM介導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷、屏障蛋白破壞、炎癥信號通路激活中具有重要的意義[9]。但HDM如何引起VEGFR2磷酸化尚不清楚。本研究首次揭示S100A4蛋白對HDM所致的哮喘氣道上皮屏障功能破壞的影響，明確S100A4蛋白在哮喘發(fā)病中的作用，國內(nèi)尚未見相關(guān)研究報道。

S100A4蛋白同時具備胞內(nèi)和胞外活性，在胞內(nèi)外分別調(diào)節(jié)多種信號通路蛋白，主要依賴鈣離子信號通路[4-5，10]。S100A4還可與連接蛋白等結(jié)合從而改變細(xì)胞遷移能力，參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換[11]。本研究發(fā)現(xiàn)S00A4-siRNA組對比con組、NC組的S100A4 mRNA表達均明顯低，Western Blot結(jié)果顯示S00A4-siRNA組蛋白表達相對NC組與con組顯著低，表示RNA干擾效果良好。同時發(fā)現(xiàn)HDM刺激可直接促使S100A4蛋白分泌增加，提示S100A4介導(dǎo)HDM對氣道上皮屏障損害的潛在可能。進而筆者采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進行S100A4干擾實驗，干擾結(jié)果顯示單純干擾下調(diào)S100A4蛋白表達并不影響16HBE上皮細(xì)胞的直接屏障功能，如跨細(xì)胞電阻和右旋糖酐通透性，亦不引起主要屏障蛋白E-cadherin和β-catenin表達變化，但卻可以抑制HDM導(dǎo)致的細(xì)胞跨細(xì)胞電阻和右旋糖酐通透性改變和屏障蛋白的表達下調(diào)。證明下調(diào)S100A4蛋白在維持氣道上皮細(xì)胞功能中具有保護作用，從而抑制哮喘的發(fā)生發(fā)展，與本文作者黃超文在國家自然科學(xué)基金青年基金的預(yù)實驗結(jié)果是一致的。

上皮細(xì)胞屏障功能體現(xiàn)為其作為第一道物理屏障，可直接抵御各種刺激物、過敏原通過上皮細(xì)胞進入上皮下，因此本文使用跨細(xì)胞電阻和通透性變化可評價此功能[12]。本研究所選擇的E-cadherin和β-catenin作為屏障蛋白的核心蛋白，除了二者可直接反映上皮細(xì)胞屏障是否被破壞之外，更重要的是E-cadherin和β-catenin可同時在氣道上皮介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和下游信號通路的激活。NF-κB在促進哮喘氣道炎癥的放大的作用已被公認(rèn)，而E-cadherin完整正常時，可抑制NF-κB活性，而破壞的E-cadherin被介導(dǎo)入核并激活NF-κB，促使多條炎癥信號通路激活[13]，E-cadherin與S100A均能共同作用于NF-κB，引起放大炎癥的作用。β-catenin則可直接激活wnt通路，介導(dǎo)黏膜下平滑肌細(xì)胞增生和成纖維細(xì)胞活化，導(dǎo)致氣道重塑[14]。

VEGFR2/p-VEGFR2信號通路的激活為本研究的另一亮點，本文作者已在動物實驗中顯示，HDM可引起哮喘小鼠的VEGFR2磷酸化，而使用VEGFR2的受體拮抗劑貝伐珠單抗可抑制屏障蛋白的破壞及下游信號通路的激活[9]。而VEGF在哮喘小鼠氣道重塑方面的作用亦被證實[15]。因此，本研究良好的銜接既往研究結(jié)果并補充了細(xì)胞實驗結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾下調(diào)S100A4蛋白可以減少p-VEGFR2的表達，這提示下調(diào)S100A4蛋白可通過抑制VEGFR2的磷酸化發(fā)揮其保護氣道上皮屏障的作用。

綜上所述，本研究通過建立S100A4-siRNA的細(xì)胞模型，成功證明了下調(diào)S100A4蛋白的表達可抑制HDM所引起的屏障功能破壞及下游VEGFR2/VEGFR2信號通路的激活，進而保護氣道上皮細(xì)胞。目前S100A4蛋白的研究主要聚焦于EMT、腫瘤發(fā)生發(fā)展中，而本文首次探討其在哮喘發(fā)病機制中的作用，為哮喘的防治提供了新的依據(jù)。

參考文獻

[1] Samitas K，Delimpoura V，Zervas E，et al.Anti-IgE treatment，airway inflammation and remodelling in severe allergic asthma：current knowledge and future perspectives[J].Eur Respir Rev，2015，24（138）：594-601.

[2] Lambrecht B N，Hammad H.Allergens and the airway epithelium response：Gateway to allergic sensitization[J].Journal of Allergy and Clinical Immunology，2014，134（3）：499-507.

[3] Georas S N，Rezaee F.Epithelial barrier function：At the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation[J].Journal of Allergy and Clinical Immunology，2014，134（3）：509-520.

[4] Dulyaninova N G，Ruiz P D，Gamble M J，et al.S100A4 regulates macrophage invasion by distinct myosin-dependent and myosin-independent mechanisms[J].Mol Biol Cell，2018，29（5）：632-642.

[5] Zhang K，Liu X，Hao F，et al.Targeting TGF-β1 inhibits invasion of anaplastic thyroid carcinoma cell through SMAD2-dependent S100A4-MMP-2/9 signaling[J].American Journal of Translational Research，2016，8（5）：2196.

[6] Kim H，Lee Y D，Kim M K，et al.Extracellular S100A4 negatively regulates osteoblast function by activating the NF-kappa B pathway[J].BMB Rep，2017，50（2）：97-102.

[7] Herwig N，Belter B，Pietzsch J.Extracellular S100A4 affects endothelial cell integrity and stimulates transmigration of A375 melanoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，477（4）：963-969.

[8] Zhang K，Yu M，Hao F，et al.Knockdown of S100A4 blocks growth and metastasis of anaplastic thyroid cancer cells in vitro and in vivo[J].Cancer Biomark，2016，17（3）：281-291.

[9] Huang C，Dong H，Zou M，et al.Bevacizumab reduced auto-phosphorylation of VEGFR2 to protect HDM-induced asthma mice[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2016，478（1）：181-186.

[10] Xia H，Gilbertsen A，Herrera J，et al.Calcium-binding protein S100A4 confers mesenchymal progenitor cell fibrogenicity in idiopathic pulmonary fibrosis[J].J Clin Invest，2017，127（7）：2586-2597.

[11] Ning Q，Li F，Wang L，et al.S100A4 amplifies TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition in a pleural mesothelial cell line[J].Journal of Investigative Medicine：the Official Publication of the American Federation for Clinical Research，2018，66（2）：334-339.

[12] George L，Brightling C E.Eosinophilic airway inflammation：role in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].Therapeutic Advances in Chronic Disease，2015，7（1）：34-51.

[13] Nawijn M C，Hackett T L，Postma D S，et al.E-cadherin：gatekeeper of airway mucosa and allergic sensitization[J].Trends in Immunology，2011，32（6）：248-255.

[14] Chen D，Zheng Z，Xiao B，et al.Corrigendum：orf virus 002 protein targets ovine protein S100A4 and inhibits NF-kappa B signaling[J].Front Microbiol，2017，8：160.

[15] Qian L，Hong J，Zhang Y，et al.Downregulation of S100A4 alleviates cardiac fibrosis via Wnt/β-Catenin pathway in mice[J].Cell Physiol Biochem，2018，46（6）：2551-2560.