劉志軍 彭從斌

[摘要] 目的 探討神經鞘內注射P300小分子干擾RNA（siRNA-P300）對神經病理性疼痛（NP）大鼠模型低氧誘導因子1α（HIF-1α）/血管內皮生長因子（VEGF）及細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）通路的影響。 方法 32只鞘內置管成功的雄性SD大鼠，隨機平均分為假手術組、模型組、陰性對照組（加入陰性對照質粒）、siRNA-P300組（加入siRNA-P300），每組各8只。坐骨神經慢性壓迫性損傷法（CCI）構建NP大鼠模型。于術前1 d及術后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、14 d檢測各組大鼠機械痛閾與熱痛閾;qRT-PCR檢測P300 mRNA水平;Western blot檢測P300、Ac-H3、HIF-1α、VEGF及ERK通路相關蛋白表達;ELISA法檢測脊髓液中疼痛介質及神經炎性因子水平。 結果 與術前相比，術后不同時間點各組大鼠機械痛閾、熱痛閾降低（P<0.05）。與假手術組相比，模型組、陰性對照組、siRNA-P300組大鼠IL-4及IL-10水平顯著降低（P<0.05），P300 mRNA和蛋白、Ac-H3蛋白、疼痛介質5-HT、SP、GABA、炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平、HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，siRNA-P300組大鼠IL-4及IL-10水平顯著升高（P<0.05），P300 mRNA和蛋白、Ac-H3蛋白、疼痛介質5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平、HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白水平顯著降低（P<0.05）。 結論 鞘內注射siRNA-P300可能通過抑制HIF-1α/VEGF和ERK通路減輕NP大鼠神經病理性疼痛。

[關鍵詞] P300;siRNA;神經鞘內轉染;神經病理性疼痛

[中圖分類號] R363.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）20-0037-06

Effect of intrathecal injection of siRNA-P300 on HIF-1α/VEGF and ERK pathways in the rat model of neuropathic pain

LIU Zhijun? ?PENG Congbin

Department of Anesthesiology， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou? ?310012， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathecal injection of P300 small interfering RNA （siRNA-P300） on the hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α）/vascular endothelial growth factor （VEGF） and extracellular signal-regulated kinase （ERK） pathways in the rat model of neuropathic pain （NP）. Methods 32 male SD rats with successful intrathecal intubation were randomly divided into sham operation group， model group， negative control group（given negative control plasmid） and siRNA-P300 group（given siRNA-P300） 8 rats in each group. The NP rat model was constructed by the chronic compression injury（CCI） of the sciatic nerve. The mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group were detected 1 day before operation and 1 day， 3 days， 5 days， 7 days， 9 days and 14 days after operation; qRT-PCR was used to detect P300 mRNA levels; Western blot was used to detect the expression of P300， Ac-H3， HIF-1α， VEGF and ERK pathway-related proteins; the level of pain mediators and neuroinflammatory factors in spinal fluid was measured by ELISA. Results There was no statistically significant difference in mechanical pain threshold and thermal pain threshold in NP rats between sham operation group before operation and 1 day to 14 days after operation（P>0.05）. Compared with the model group， the negative control group and the siRNA-P300 group before operation， the mechanical pain threshold and thermal pain threshold of the NP rats in each group were significantly decreased at different time points（P<0.05）. Compared with the sham operation group， the IL-4 and IL-10 levels in the model group， negative control group and siRNA-P300 group were significantly lower（P<0.05）. P300 mRNA and protein， Ac-H3 protein， pain mediators of 5-HT， SP， GABA， inflammatory factors of IFN-γ， TNF-α， IL-1β levels，HIF-1α，VEGF，p-ERK， p-CREB and BDNF protein levels were significantly increased（P<0.05）. Compared with the model group， IL-4 and IL-10 levels were significantly increased in the siRNA-P300 group（P<0.05）. P300 mRNA and protein， Ac-H3 protein， pain mediators of 5-HT， SP， GABA and inflammatory factors of IFN-γ，TNF-α，IL-1β levels， HIF-1α， VEGF， p-ERK， p-CREB and BDNF protein levels were significantly reduced（P<0.05）. Conclusion Intrathecal injection of siRNA-P300 may attenuate neuropathic pain in NP rats by inhibiting HIF-1α/VEGF and ERK pathways.

[Key words] P300; siRNA; Intrathecal transfection; Neuropathic pain （NP）

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）主要是指神經系統(tǒng)原發(fā)性損害及其功能障礙引發(fā)的一種慢性疼痛疾病，其主要臨床特征為痛覺過敏、感覺異常、自發(fā)性疼痛等[1]。NP發(fā)病機制較為復雜，既往研究顯示NP發(fā)病機制涉及生物化學、解剖學、分子生物及電生理基礎等方面[2]。研究表明P300蛋白作為組蛋白乙酰化轉移酶家族一員可通過調控疼痛介質及神經炎癥反應等表達進而參與神經疼痛發(fā)生及發(fā)展過程[3]。故而P300蛋白是否可作為NP治療靶點成為熱點研究。研究表明細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular-signa1 regulated kinase，ERK）信號通路活化與NP發(fā)生有關，甘丙肽受體-1可通過抑制ERK通路激活進而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[4]。ERK還可調控低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）/血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路，研究發(fā)現(xiàn)通過抑制ERK表達可抑制HIF-1α/VEGF信號通路進而抑制高糖誘導視網膜血管生成[5]。關于HIF-1α/VEGF、ERK信號通路與NP發(fā)生及發(fā)展的研究相對較少，因此本研究采用鞘內注射P300小分子干擾RNA（siRNA-P300）并分析其對NP大鼠模型的鎮(zhèn)痛效果，探究其對HIF-1α/VEGF、ERK信號通路的影響，為探尋NP治療方案提供可能治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠32只，體重為200～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0012。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器? 脂質體Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司（批號：20171203）;siRNA-P300購自上海吉瑪公司;Trizol（批號：2017 1003）、反轉錄（批號：20171105）及SYBRTM GreenERTM Kit試劑盒（批號：20171014）均購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司;兔抗鼠P300（批號：2026035）、Ac-H3多克隆抗體（批號：2026021）均購自美國Santa Cruz公司;兔抗鼠HIF-1α單克隆抗體（批號：2022056）購自美國Millipore公司;兔抗鼠VEGF多克隆抗體購自美國Abcam公司（批號：GR51277）;ERK（批號：12607）及其磷酸化p-ERK（批號：12608）、轉錄環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）（批號：12713）及其磷酸化p-CREB（批號12715）、腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）（批號：12806）多克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（批號：102063）購自北京中杉金橋生物技術有限公司;人5羥色胺（5-HT）（批號：20170613）、SP（批號：20170621）、A型γ-氨基丁酸（GABA）（批號：20170615）、γ-干擾素（IFN-γ）（批號：20170618）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號：20170622）、白細胞介素-1β（IL-1β）（批號：20170701）、白細胞介素-4（IL-4）（批號：20170712）、白細胞介素-10（IL-10）（批號：20160608）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（ELISA）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;蛋白裂解液與BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。CFX96Touch實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-RAD公司;iBright 智能凝膠成像分析系統(tǒng)及Quantity One分析軟件均購自美國Thermo Fisher公司;Electronic von Frey Anesthesiometer型電子Von Frey測痛儀購自自然基因科技有限公司;7370熱痛儀購自意大利UGO公司;Du-640紫外分光光度計購自美國貝克曼公司。

1.2.2 NP模型建立及分組? 麻醉大鼠并將其仰臥固定，采用腰段鞘內置管法進行鞘內置管，其具體操作參照相關文獻報道[6]，術后導管外口被封閉的硬膜外導管罩住以防止腦脊液外漏，并觀察術后大鼠活動情況并對導管置入位置進行評價，所有大鼠均使用青霉素進行抗感染且均單獨飼養(yǎng)。選取鞘內置管成功的大鼠32只，隨機選取8只大鼠作為假手術組，其余大鼠建立NP模型，采用坐骨神經慢性壓迫性損傷法（chronic constriction jinury，CCI）構建NP大鼠模型，術后NP大鼠痛閾明顯升高提示造模成功[7]。將造模成功的大鼠分為模型組、陰性對照組、siRNA-P300組，每組各8只。陰性對照組：配置20 μL陰性轉染試劑（4 μg siRNA-NC陰性質粒溶于20 μL Lipofectamine），術后3 d時鞘內注射劑量為每天2次，每次10 μL;siRNA-P300組：配置20 μL siRNA-P300（4 μg siRNA-P300轉染試劑溶于20 μL Lipofectamine），術后3 d時鞘內注射劑量為每天2次，每次10 μL;模型組與假手術組大鼠每天注射等量生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.2.3 監(jiān)測機械痛閾與熱痛閾? 分別于術前1 d及術后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、14 d檢測各組大鼠機械痛閾與熱痛閾，機械痛閾檢測方法：將透明塑料鼠籠作為測試地，分別將各組大鼠置于測試圈內，30 min后校正Von Frey測痛儀零點并采用探針刺激大鼠后爪腳掌，此時大鼠縮爪時測痛儀顯示的壓力值即為機械痛閾值。熱痛閾檢測方法：分別將各組大鼠置于玻璃板上（厚度約3 mm）并采用透明塑料籠罩住，30 min后采用紅外光源照射大鼠足底并計時，大鼠感到疼痛自覺將后足抬起時停止計時，紅外光源照射前后時間差值即為熱痛閾。機械痛閾與熱痛閾檢測均重復3次并求取平均值。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測P300 mRNA表達水平? 轉染培養(yǎng)14 d后處死大鼠并采集各組大鼠腰段脊髓并置于-80℃超低溫冰箱保存待測。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測P300 mRNA表達水平，取凍存脊髓，液氮中研磨，加入10 μL Trizol試劑提取總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，參照反轉錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR反應體系共20μL：SYBR Green Mstermix 10 μL，cDNA樣本1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。P300上游引物5'-GCCAAGTATGCCAACCCTAA-3'，下游引物5'-TGTTCATTTGCTGAGCTTGG-3';GAPDH上游引物-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物5'-GGTGGTGAAGACGCCAGTAG-3'。反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt相對定量法計算P300 mRNA的相對表達量。

1.2.5 檢測NP大鼠脊髓液中疼痛介質及神經炎性因子水平? 轉染后14 d時處死大鼠并分離第5腰椎對應的脊髓組織，加入0.3 mL蛋白裂解液并在冰上充分研磨，3000 r/min轉速離心10 min，分離上清液并采用ELISA法檢測5-HT、SP、GABA、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，同時采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白含量，計算每毫克總蛋白中各指標含量。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測P300、Ac-H3、HIF-1α/VEGF及ERK通路相關蛋白表達? 取凍存大鼠脊髓，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠脊髓中P300、Ac-H3、HIF-1α、VEGF、ERK、p-ERK、CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達。根據蛋白濃度加入SDS樣本緩沖液，加入蛋白裂解液將各樣本配制終濃度為100 mg/mL的溶液，取10 μL蛋白樣品點入15% SDS-PAGE上并分離不同分子量蛋白，采用預冷轉移緩沖液將蛋白移至PDVF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗，稀釋比均為1：200，放入4℃冰箱保存過夜，次日采用TBST洗膜，加入二抗（1：5000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，采用ECL液顯色并曝光顯影，置于凝膠分析儀并采用圖像合理性軟件分析各蛋白條帶。以GADPH為內參，各目的蛋白條帶灰度值與內參GADPH的比值表示各目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0分析數據，計量資料符合正態(tài)分布的數據均以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析;計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，各組數據均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 siRNA-P300鞘內注射對NP大鼠機械痛閾的影響

與術前比較，術后不同時間點各組NP大鼠機械痛閾均顯著降低（P<0.05）;與假手術組比較，模型組、陰性對照組及siRNA-P300組術后NP大鼠機械痛閾均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，siRNA-P300組術后5 d、7 d、9 d、11 d NP大鼠機械痛閾顯著升高（P<0.05），模型組與陰性對照組比較差異不顯著（P>0.05）。見表1。

2.2 siRNA-P300鞘內注射對NP大鼠熱痛閾的影響

與術前比較，術后不同時間點各組NP大鼠熱痛閾均顯著降低（P<0.05）;與假手術組比較，模型組、陰性對照組及siRNA-P300組術后不同時間點NP大鼠熱痛閾均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組和陰性對照組比較，siRNA-P300組術后5 d、7 d、9 d、14 d時NP大鼠熱痛閾顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），模型組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組NP大鼠P300、Ac-H3蛋白表達水平

與假手術組比較，模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠P300 mRNA蛋白及Ac-H3蛋白表達水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組及陰性對照組比較，siRNA-P300組NP大鼠P300 mRNA蛋白及Ac-H3蛋白表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），模型組與陰性對照組比較，差異不顯著（P>0.05）。見圖1、表3。

2.4 siRNA-P300鞘內注射對NP大鼠神經疼痛及炎癥反應程度的影響

與假手術組比較，模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中疼痛介質5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平均顯著升高（P<0.05），IL-4與IL-10水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組及陰性對照組相比，siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），IL-4與IL-10水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;模型組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4、表5。

2.5 siRNA-P300鞘內注射對NP大鼠HIF-1α/VEGF、ERK通路的影響

與假手術組比較，模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），ERK與CREB蛋白表達水平比較差異不顯著（P>0.05）;與模型組及陰性對照組相比，siRNA-P300組NP大鼠HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），ERK與CREB蛋白表達水平比較，差異差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且模型組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2、表6。

3 討論

目前關于NP確切發(fā)病機制及其具體發(fā)生過程均尚未完全闡明，臨床尚缺乏有效治療手段，因而探究NP發(fā)生機制及有效治療方法成為研究熱點[8]。既往研究表明物理性機械損傷、病毒感染、缺血性神經損害等均可引發(fā)NP[9]。為了進一步研究NP發(fā)病機制建立各種動物NP模型，研究表明CCI、坐骨神經分支選擇損傷模型（SNI）、脊神經選擇結扎模型（SNL）等均為常用NP模型，其中CCI模型主要特征為外周及中樞敏化，并可采用機械痛閾、熱痛閾檢測疼痛行為，且具有操作簡單、創(chuàng)傷性小等優(yōu)點[10]。因此，本研究通過構建CCI模型進一步探究NP有效治療方法及其可能作用機制，為提高NP治療效果提供一定理論依據。

P300屬于組蛋白乙酰轉移酶且具有輔助激活因子作用，組蛋白去乙?；缚蓪P發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，進一步研究顯示大鼠脊髓中P300表達水平升高并可促進NP發(fā)生[11-12]，但關于其具體作用機制及可能作用通路尚未解釋清楚。研究顯示在SNL大鼠模型鞘內注射P300抑制劑可能通過抑制P300介導p65乙?；⒋偈购艘蜃应蔅（NF-κB）表達水平降低，這可為神經疼痛的治療提供靶點[13]。本研究構建CCI模型并采用siRNA-P300鞘內注射觀察大鼠機械痛閾及熱痛閾變化，結果顯示術后不同時間點各組NP大鼠機械痛閾及熱痛閾均明顯降低，提示NP模型大鼠造模成功。術后5 d、14 d siRNA-P300組NP大鼠機械痛閾及熱痛閾均明顯高于模型組、陰性對照組，說明鞘內注射P300的siRNA可有效提高NP大鼠痛閾，提示P300在NP發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠P300 mRNA、蛋白及Ac-H3蛋白表達水平均顯著高于假手術組，siRNA-P300組顯著低于模型組，其中組蛋白Ac-H3屬于P300乙?；饔玫孜颷14]，分析原因可能為siRNA-P300可通過抑制脊髓P300表達并減弱P300介導的組蛋白乙酰化作用進而抑制下游疼痛基因表達。提示siRNA-P300鞘內注射可提高NP大鼠痛閾。神經免疫系統(tǒng)紊亂及炎癥介質異常分泌可引發(fā)NP，因而探討siRNA-P300鞘內注射對NP大鼠體內炎性介質的影響具有重要意義[15]。進一步分析siRNA-P300鞘內注射對NP大鼠神經炎癥反應及疼痛介質的影響，結果顯示模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中5-HT、SP、GABA及炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平均顯著高于假手術組，siRNA-P300組顯著低于模型組、陰性對照組;模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠脊髓液中IL-4與IL-10水平顯著低于假手術組，siRNA-P300組顯著高于模型組，其中疼痛介質合成及分泌異常均可引起疼痛覺，神經源性炎性因子激活又可進一步促進疼痛介質分泌，SP物質屬于速激肽并可與膜受體結合進而增加神經元放電導致疼痛覺的產生，5-HT可與神經元受體結合并啟動內向電流進而增加痛覺敏感性，GABA可與神經元突出結構相互作用進而引發(fā)疼痛覺，同時促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β與抗炎因子IL-4、IL-10分泌紊亂可促進神經源性炎癥發(fā)生進而引起疼痛[16]。本研究結果表明促炎因子水平升高及抗炎因子水平降低可促進神經源性炎癥發(fā)生并進一步促進疼痛介質5-HT、SP、GABA異常分泌進而引起NP的發(fā)生，鞘內注射siRNA-P300可通過抑制促炎因子、疼痛介質分泌并增加抗炎因子分泌進而神經源性炎癥從而減緩疼痛程度。提示鞘內注射siRNA-P300可有效減輕NP大鼠疼痛程度。

ERK/CREB通路磷酸化可參與BDNF保護及修復背根神經節(jié)過程，BDNF是神經營養(yǎng)因子之一并可調控神經細胞分化及再生[17]。BDNF可與其受體結合進而促進疼痛形成，抑制ERK/CREB通路可降低BDNF表達水平并有效改善CCI誘發(fā)痛覺過敏特征，ERK/CREB、BDNF通路激活可參與NP形成過程[18]。研究表明通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/ERK（MAPK/ERK）信號通路可降低HIF-1α、VEGF相關蛋白表達水平進而有效改善老年缺血性腦卒中患者認知功能障礙[19]。推測ERK/CREB信號通路與HIF-1α/VEGF信號通路是否共同參與NP發(fā)生過程。呂翠巖等[20]研究表明通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路相關蛋白表達可對糖尿病大鼠坐骨神經發(fā)揮保護作用。同時P300還可通過與CREB結合蛋白相互作用進而參與NP發(fā)生及發(fā)展過程[21]。以上研究均表明ERK/CREB及HIF-1α/VEGF信號通路均與NP發(fā)生密切相關。本研究結果顯示模型組、陰性對照組及siRNA-P300組NP大鼠HIF-1α、VEGF、p-ERK、p-CREB及BDNF蛋白表達水平均高于假手術組，siRNA-P300組低于模型組、陰性對照組，說明siRNA-P300可有效抑制ERK/CREB及HIF-1α/VEGF信號通路。提示siRNA-P300可能通過抑制HIF-1α/VEGF及ERK/CREB信號通路進而抑制NP大鼠神經病理性疼痛。

綜上所述，鞘內注射siRNA-P300可緩解NP大鼠神經病理性疼痛，其可能作用機制與抑制HIF-1α/VEGF及ERK/CREB信號通路有關，其將會增加對NP發(fā)病機制的認識并可能成為治療NP的新靶點，為未來疼痛藥物的開發(fā)提供重要方向。但關于siRNA-P300可能通過作用于哪些蛋白發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用及其可能分子機制均需深入研究。

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