張紅蕾 李佳 李大鵬 王榮麗 郭睿

(1. 中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科 北京 100142；2.河北省保定市第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 保定 071051；3.安徽省亳州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 亳州 236800)

喉癌手術(shù)切緣的傳統(tǒng)研究方法主要是臨床和病理觀察，隨著免疫組化技術(shù)及分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來已達(dá)到了細(xì)胞和分子水平。細(xì)胞周期素D1是重要的細(xì)胞周期素蛋白，作為細(xì)胞周期的正向調(diào)控因素，其異常表達(dá)是導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受到破壞的主要原因之一，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。有研究[2]表明，細(xì)胞周期素D1在正常組織中表達(dá)量很少甚至不表達(dá)，而在包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的人體許多惡性腫瘤中存在該蛋白質(zhì)的過度表達(dá)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子家族(STATs)于20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)，STAT3是其重要成員[3]；但是，STAT3的表達(dá)與喉癌患者手術(shù)切緣、術(shù)后復(fù)發(fā)情況以及臨床病理情況的關(guān)系卻鮮有報道。本文應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測聲門上喉癌手術(shù)切除標(biāo)本中不同切緣部位喉癌組織的STAT3蛋白表達(dá)情況，并對上述問題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 2008～2017年收治的手術(shù)切緣常規(guī)病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的聲門上喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)患者82例，其中男性55例、女性27例；年齡39～73歲，中位年齡58.2歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂標(biāo)準(zhǔn)；病例排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受放療、化療等的患者。其中高分化19例、中分化37例、低分化26例；TNM分期：T1期13例、T2期23例、T3期28例、T4期18例。標(biāo)本取得后立即測量肉眼下距腫瘤最短的切緣距離，將其按2、5、10、25 mm分為4組。將所有標(biāo)本水平連續(xù)切成5 mm厚的組織片，將最短切緣組織片從切緣向腫瘤邊緣縱向再次連續(xù)切片制成4～5 μm厚的薄組織片用于免疫組化檢測。對照組75例正常喉組織取自同期全喉切除標(biāo)本的遠(yuǎn)端組織，距腫瘤邊緣超過3 cm，病理檢查確認(rèn)為正常喉黏膜上皮，同樣制成4～5 μm厚的組織片。所有患者術(shù)后隨訪3年。本研究通過我院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 試劑來源 STAT3兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology(CST)，SP試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 方法 采用免疫組化染色SP法。切片脫蠟水化，微波熱修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑滅活過氧化物酶活性，滴加正常羊血清封閉液，滴加一抗(STAT3兔單克隆抗體)后于4 ℃過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗37 ℃ 1 h，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶溶液；DAB法顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蘇木素復(fù)染2 min。用已知陽性組織切片作陽性對照[4]，用磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對照。

STAT3陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，高倍鏡下任取5個視野進(jìn)行計數(shù)，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞。著色細(xì)胞<5%為陰性(-)，5%～29%為弱陽性(+)，30%～49%為中度陽性(++)，≥50%為強陽性(+++)[5]。

所有喉癌患者術(shù)后定期復(fù)診隨訪，行纖維喉鏡檢查，了解喉內(nèi)情況有無局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，觀察切緣STAT3表達(dá)水平與喉癌術(shù)后局部切緣復(fù)發(fā)的關(guān)系。由于本研究重點在病理學(xué)方面，因此隨訪過程中沒有對患者進(jìn)行增強CT或者增強MRI檢查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。切緣STAT3陽性表達(dá)患者不同切緣長度組間復(fù)發(fā)率、切緣STAT3在不同病理資料組間陽性表達(dá)率的比較均用χ2檢驗，切緣STAT3表達(dá)陰性和陽性2組間生存分析采用對數(shù)秩(Log-rank)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT3陽性表達(dá)患者不同切緣距離與復(fù)發(fā)的關(guān)系 82例喉癌組織中STAT3陽性表達(dá)68例，陽性率為83%。該68例癌組織STAT3陽性表達(dá)者中，24例切緣檢測到STAT3陽性表達(dá)。該24例患者中，17例發(fā)生局部復(fù)發(fā)，STAT3切緣陽性患者復(fù)發(fā)率為70.8%(17/24)， STAT3切緣陰性表達(dá)者7例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為15.9%(7/44)，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.315，P<0.05)。2組STAT3表達(dá)比較：復(fù)發(fā)組STAT3表達(dá)強陽性(+++)、中度陽性(++)的構(gòu)成比例明顯高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=8.216，P<0.05)。

通過對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher精確概率法兩兩組間比較，結(jié)果顯示，切緣(5 mm處和切緣10 mm處)STAT3的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.380，P<0.05)，切緣2 mm處STAT3的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.748，P>0.05)，切緣10 mm處與25 mm處STAT3的陽性表達(dá)率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.524，P>0.05；表1)。

表1 STAT3 蛋白在喉癌組織和癌旁不同距離組織中的表達(dá)

結(jié)果提示，以切緣 STAT3 陽性表達(dá)與否作為輔助評判標(biāo)準(zhǔn)，安全切緣位于距腫瘤邊緣5 mm處。

2.2 切緣 STAT3陽性與陰性表達(dá)患者的生存分析 術(shù)后隨訪3年，48例STAT3陽性表達(dá)患者中失訪5例，包括切緣陽性患者2例、切緣陰性患者3例。隨訪資料完整的15例切緣陽性患者死亡11例，28例切緣陰性患者死亡4例，Kaplan-Meiel生存曲線見圖1。Log-rank檢驗切緣陰性組生存率高于陽性組(Log-rank=6.657，P<0.05)。

2.3 切緣STAT3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 詳見表2。

圖1. Kaplan-Meiel生存曲線

表2 切緣 STAT3陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

喉癌切緣STAT3陽性表達(dá)率在頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.741，P<0.05)。喉癌切緣STAT3陽性表達(dá)率在臨床分期T3及T4組顯著高于T1及T2組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.612，P<0.05)，但在T3、T4組與T1、T2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。喉癌切緣STAT3陽性表達(dá)率在組織病理高、中、低分化3組間兩兩比較的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。

3 討論

喉癌是耳鼻喉科常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有逐漸增多趨勢，由于其所處部位為呼吸及發(fā)聲的重要器官，所以對患者危害性極大，手術(shù)是目前治療喉癌的主要措施[6]。手術(shù)治療一方面需要盡可能地完整切除腫瘤，另一方面也需盡量保留喉功能。因此，原發(fā)病灶的切除范圍即喉癌手術(shù)安全切緣問題得到臨床醫(yī)師的重視。目前判斷手術(shù)切緣組織是否有腫瘤組織殘留的常規(guī)方法是冷凍或石蠟切片病理診斷，根據(jù)切片中癌細(xì)胞殘留與否判斷其是否為安全切緣[7-9]。導(dǎo)致切緣病理假陰性的原因：一方面目前組織病理診斷技術(shù)尚不能檢測出少量甚至微量的殘留腫瘤細(xì)胞，即微轉(zhuǎn)移灶[10]；另一方面可能存在已出現(xiàn)了分子水平改變的癌前病變細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。目前已有很多學(xué)者應(yīng)用免疫組化的方法檢測病理陰性切緣組織的某些蛋白分子的異常表達(dá)，并對手術(shù)安全切緣進(jìn)一步定性判斷，已證明P53、ras、c-myc、MMP-2、c-FLIP、RECK、Survivin等多種蛋白在喉癌組織、近癌組織、遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[11-13]。

細(xì)胞周期素作為細(xì)胞周期重要的正性調(diào)節(jié)因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色日益成為關(guān)注的焦點，其中STAT3是已被證實與腫瘤有最直接關(guān)系的癌基因，其作用機(jī)制與Rb蛋白產(chǎn)物(pRb)密切相關(guān)。STAT3/CDK4復(fù)合物中細(xì)胞周期素D1能與pRb結(jié)合使其磷酸化，pRb被磷酸化后釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，后者通過激活基因轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞進(jìn)入S期。而細(xì)胞周期素D1與喉癌的密切關(guān)系也已得到很多學(xué)者的證實[14]。炎性肝細(xì)胞腺瘤(inflammatory hepatocellular adenma，IHCA)是一種良性肝臟腫瘤，以炎性浸潤和急性期嚴(yán)重反應(yīng)過表達(dá)為特點。Pilati等的報道顯示，60%的IHCA是通過IL-6家族的細(xì)胞因子共受體gp130的體細(xì)胞框內(nèi)缺失而激活STAT3。在第46屆歐洲肝臟研究學(xué)會(EASL)年會上，Pilati報告了在其余IHCA患者中探索新的STAT3激活機(jī)制的研究，結(jié)果顯示人類腫瘤中具有體細(xì)胞STAT3突變，人類腫瘤中STAT3激活的這種新機(jī)制，可以被Src抑制劑阻斷。同時，研究結(jié)果強調(diào)了Src-STAT3通路作為良性肝腫瘤發(fā)生中關(guān)鍵事件的作用。研究者對114例腺瘤的STAT3編碼區(qū)進(jìn)行測序，對所有識別出的基因突變通過定點誘變進(jìn)行復(fù)制，其功能性影響通過定量RT-PCR和STAT3-報告基因，在肝癌細(xì)胞株Hep3B、HepG2或HuH7中進(jìn)行分析。STAT3磷酸化水平和細(xì)胞定位分別通過免疫印跡和免疫熒光分析。為明確STAT3突變激活的機(jī)制，研究者進(jìn)行免疫沉淀分析，并使用RNA干擾和藥理學(xué)藥物靶定STAT3的伙伴基因。結(jié)果顯示，12%的非突變gp130 IHCA中可見雜合型體細(xì)胞STAT3突變，而在其他HCA亞型中未發(fā)現(xiàn)此突變。這些突變多數(shù)導(dǎo)致SH2區(qū)域的氨基酸替代，該區(qū)域?qū)TAT3的二聚作用很重要。不同于野生型STAT3，所有STAT3突變體可以在無配體情況下激活所有細(xì)胞系中的白細(xì)胞介素-6(IL-6)信號傳導(dǎo)。而且研究者發(fā)現(xiàn)，突變STAT3的組成性激活需要酪氨酸705的磷酸化和STAT3突變集中在細(xì)胞核。此外，在無配體刺激下，STAT3突變體可以形成同源二聚體，其對IL-6暴露高度敏感。使用2種不同的Src抑制劑，可見基線STAT3突變活性有賴于Src酪氨酸激酶。相反，JAK抑制劑和SiRNA分析顯示，在STAT3突變的組成性激活中并不需要gp130和JAK激酶。

STAT3是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，它通過外界可以直接對相應(yīng)靶基因進(jìn)行激活轉(zhuǎn)錄。本實驗檢測聲門上喉癌患者癌旁組織不同距離STAT3蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示STAT3 蛋白的陽性表達(dá)率為 93%，相對于正常組織12%的陽性率，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。喉癌組織的STAT3陽性率明顯高于正常組織，并且由內(nèi)向外遞減[15-16]。相關(guān)研究表明，STAT3可以通過編碼凋亡抑制劑以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑等上調(diào)其基因表達(dá)，對腫瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行干預(yù)，很有可能對聲門上喉癌的腫瘤組織診斷、治療提供病理學(xué)的靶向指標(biāo)。采用免疫組化染色SP法，通過對聲門上喉癌的癌組織及癌旁不同距離組織中STAT3 的表達(dá)情況進(jìn)行分析，可以了解到正常喉癌組織中的STAT3顯著表達(dá)于喉癌組織和對應(yīng)的癌旁>20 mm處正常組織[17]。我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測喉癌不同切緣長度STAT3表達(dá)情況及其與復(fù)發(fā)率的關(guān)系，進(jìn)而從分子水平分析喉癌手術(shù)切除界限。

本研究所選82例喉癌樣本中有68例癌組織STAT3陽性表達(dá)，其手術(shù)切緣常規(guī)病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞即病理切緣陰性，但仍有24例患者復(fù)發(fā)，切緣STAT3陽性表達(dá)組與切緣STAT3陰性表達(dá)組間復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示STAT3可作為補充病理切緣診斷的分子預(yù)警標(biāo)志。進(jìn)一步分析，在切緣STAT3陽性表達(dá)的患者中，切緣25 mm與10 mm組間復(fù)發(fā)率比較的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而切緣2 mm與5 mm組間以及切緣10 mm與25 mm組間復(fù)發(fā)率比較的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示安全切緣位于5 mm處為宜。這與目前被廣泛接受的安全切緣距離相一致[18]。很多學(xué)者對喉癌術(shù)后患者進(jìn)行生存分析，結(jié)果均提示手術(shù)切緣情況與其預(yù)后密切相關(guān)。病理切緣陰性和陽性患者的生存率和復(fù)發(fā)率明顯不同，陽性患者預(yù)后差。

盡管本研究所選病例全部為病理切緣陰性標(biāo)本，但STAT3的表達(dá)情況不同，STAT3陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組的生存率差異仍具統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank=5.83，P<0.05)，說明STAT3可作為喉癌術(shù)后預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[19]。我們將喉癌患者手術(shù)切緣中STAT3的表達(dá)情況與臨床病理資料綜合分析發(fā)現(xiàn)，喉癌切緣中STAT3的陽性表達(dá)顯著集中在T3、T4期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例，說明腫瘤浸潤范圍較廣以及有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，STAT3陽性切緣發(fā)生率增高，這與目前部分學(xué)者研究的病理切緣陽性與腫瘤分期及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系相一致，但STAT3作為分子標(biāo)志更加敏感。本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)STAT3的表達(dá)與組織分化程度存在明顯相關(guān)[20-21]。

當(dāng)然，鑒于本研究樣本量有限，部分結(jié)果尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并反復(fù)驗證以保證結(jié)果的有效臨床參考意義。雖然喉癌手術(shù)方法在不斷改進(jìn)，但晚期喉癌5年生存率未見明顯改善，將STAT3等分子標(biāo)志物應(yīng)用于喉癌的診斷及治療中，有利于更好地評估手術(shù)安全切緣及預(yù)測腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力，亦為臨床提供更多可能的靶向治療途徑。