劉月月 殷斌 林樹乾 李桂明 趙增成 黃中利 傅劍 楊世發(fā)

摘要：采用水煎法制備五味子水提物（SCD），通過SCD的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度檢測和紙片擴(kuò)散抑制試驗(yàn)評(píng)估SCD的體外抑菌活性，通過SCD對雛雞感染大腸桿菌的治療試驗(yàn)評(píng)估SCD的體內(nèi)抑菌活性。結(jié)果顯示，SCD對6株標(biāo)準(zhǔn)株和6株大腸桿菌分離株均具有顯著的抑菌活性。SCD對雛雞感染大腸桿菌的治療試驗(yàn)結(jié)果顯示，口服SCD可以顯著降低感染大腸桿菌雛雞的死亡率。這表明SCD具有良好的抑菌活性，且對環(huán)丙沙星耐藥的大腸桿菌均有效，可以作為治療細(xì)菌性疾病的備選藥物。

關(guān)鍵詞：五味子;水提物;抗菌活性;耐藥大腸桿菌;SPF雞

中圖分類號(hào)：S476.8 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2019）08-0118-05

Abstract The aqueous extract of Schisandra chinensis （SCD） was prepared by water decoction， and the antimicrobial activity of SCD in vitro was assessed through minimal inhibitory concentration， minimal bactericidal concentration test and Kirby-Bauer zone of inhibition assay. In addition， the antimicrobial activity of SCD in vivo was tested through therapeutic effect of oral SCD on chickens infected Escherichia coli. The results showed that SCD exhibited excellent antimicrobial activity against all the six reference bacterial strains and six field E. coli strains. Therapeutic experiment found oral SCD could significantly reduce the mortality of chickens infected by E. coli. It suggested that SCD could serve as an excellent antibacterial agent for treating bacterial infections， including CIP-resistant E. coli strains.

Keywords Schisandra chinensis;Aqueous extract;Antimicrobial activity; Ciprofloxacin-resistant Escherichia coli; SPF chicken

細(xì)菌性疾病嚴(yán)重危害人類健康，是引起世界范圍內(nèi)死亡的主要原因之一。盡管在抗生素治療方面取得進(jìn)步，有效控制了傳染病的流行和發(fā)生，但耐藥菌的出現(xiàn)和增加成為一個(gè)新的問題[1]。多重耐藥性細(xì)菌不僅對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，而且也成為獸醫(yī)和畜牧業(yè)中最緊迫的問題之一[2]，對社會(huì)和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了巨大影響。因此，研發(fā)新型有效的抗菌藥物成為研究熱點(diǎn)。

在中獸醫(yī)上廣泛應(yīng)用的藥用植物往往含有具有抗菌特性的生物活性成分，成為新獸藥研發(fā)材料的重要來源[3-6]。最近研究發(fā)現(xiàn)烏梅、五味子和黃連的混合提取物對各種沙門氏菌和大腸桿菌具有抗菌作用，包括一些對多種抗生素有耐藥性的菌株[7， 8]。五味子提取物可以極大減少食物中腸球菌的活菌數(shù)而不會(huì)降低食物品質(zhì)，顯著降低芽孢桿菌的存活率并增加其熱敏感性，且對幽門螺旋桿菌也有抑制活性[9-11]，具有替代傳統(tǒng)抗生素的可能。

本研究通過檢測SCD對6株標(biāo)準(zhǔn)株、6株大腸桿菌分離株的抑菌活性和SCD對感染大腸桿菌雛雞的治療性試驗(yàn)，旨在為明確五味子的抑菌活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

五味子，購自山東建聯(lián)中藥店;環(huán)丙沙星（ciprofloxacin， CIP），由中國食品藥品檢定研究院（NICPBP）提供，批號(hào)為130451-201502;麥康凱培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯等細(xì)菌培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;藥敏試紙，購自杭州天河微生物試劑有限公司;無特定病原（SPF）雞，購自山東昊泰繁育有限責(zé)任公司。

標(biāo)準(zhǔn)菌株由NICPBP提供，分別為大腸桿菌[CMCC（B）44102]、沙門氏菌[CMCC（B）50071]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、短小芽孢桿菌[CMCC（B）63202]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]和藤黃微球菌[CMCC（B）28001]。6株大腸桿菌分離株于山東多個(gè)養(yǎng)殖場分離得到，標(biāo)記為08-09、08-17、08-30、09-05、10-16和11-14。

1.2 五味子水提物的制備

準(zhǔn)確稱取五味子，加3倍重量蒸餾水浸泡1 h后，文火煎煮30 min，過200目篩，取上清濃縮至質(zhì)量濃度為含生藥1 g/mL。121℃高壓滅菌15 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前常溫放? h。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

本研究共對6株標(biāo)準(zhǔn)菌株和6株大腸桿菌分離株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。在無菌條件下用劃線法將冷凍保存的供試菌種接于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，于37℃溫箱培育18～24 h。將活化好的菌種在無菌條件下挑單個(gè)菌落接入液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)18～24 h。用無菌生理鹽水稀釋后經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，制成? × 108 cfu/mL的菌懸液。

1.4 Kirby-Bauer（K-B）耐藥性檢測

K-B檢測采用牛津杯法。用涂布器將試驗(yàn)菌均勻接種到MH平板培養(yǎng)基上，在無菌環(huán)境中將滅菌的牛津小杯放在培養(yǎng)基上，輕輕加壓以確保緊密接觸，移液槍吸取300 μL濃度分別為1.00、0.50、0.25 mg/mL的SCD和濃度分別為8、4 μg/mL的CIP藥液注入牛津小杯，蓋好陶瓷瓦蓋，37℃溫箱培養(yǎng)16～24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每種藥物重復(fù)三次取平均值。

1.5 最小抑制濃度和最低殺菌濃度檢測

將10 mg/mL SCD在MH肉湯中連續(xù)倍比稀釋，制備11個(gè)含有SCD不同濃度系列的培養(yǎng)基。含8 μg/mL和4 μg/mL CIP的培養(yǎng)基作為藥物對照組，不添加藥物的培養(yǎng)基作為陰性對照組。用上述培養(yǎng)基分別對12株菌進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后計(jì)算SCD和CIP的最小抑制濃度（MIC），48 h后計(jì)算SCD和CIP的最低殺菌濃度（MBC）。

1.6 雞感染大腸桿菌病理模型的構(gòu)建

將300只20日齡SPF雞隨機(jī)分成6組（Ⅰ～Ⅵ）。Ⅰ～Ⅴ組為人工感染大腸桿菌08-30菌株，腹腔注射濃度分別為0.25×108、0.5×108、1× 108、2×108、4×108 cfu/mL的大腸桿菌0.2 mL。第Ⅵ組為空白對照組，注射0.2 mL生理鹽水。人工感染后，觀察和記錄臨床癥狀、發(fā)病時(shí)間、發(fā)病率和死亡率，并計(jì)算大腸桿菌的半數(shù)致死量，以確定大腸桿菌感染雞模型的攻毒劑量。

1.7 體內(nèi)抑菌活性的研究

將200只20日齡SPF雞隨機(jī)分為5組（Ⅰ～Ⅴ），分別為三個(gè)不同濃度SCD治療組（Ⅰ～Ⅲ）、攻菌組（Ⅳ）和空白對照組（Ⅴ）。Ⅰ～Ⅳ組腹腔均注射0.2 mL 1×半數(shù)致死量的細(xì)菌，Ⅴ組腹腔注射0.2 mL生理鹽水。攻菌后6 h，Ⅰ～Ⅲ組的雞分別口服濃度為100、200、400 g/mL SCD 0.2 mL，連續(xù)三天，每天兩次。Ⅳ組和Ⅴ組用等量生理鹽水代替SCD。觀察記錄96 h內(nèi)大腸桿菌感染相關(guān)癥狀、雞的總體精神狀態(tài)并計(jì)算死亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同試驗(yàn)組之間的差異分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離株的鑒定

采用生化試驗(yàn)對6株分離株進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表1所示。6株分離株均能發(fā)酵乳糖，吲哚和甲基紅試驗(yàn)呈陽性，VP試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)均為陰性，表明6株分離株均為大腸桿菌菌株。K-B試驗(yàn)表明08-09菌株對CIP敏感，形成的抑菌圈平均大小為15.78 mm，其他5株菌株對環(huán)丙沙星具有高度耐藥性。

2.2 SCD的抑菌活性

K-B抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，SCD對12株供試菌均顯示出抑菌活性（表2、表3）。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，SCD的抑菌圈平均直徑在19.39～29.34 mm。8 μg/mL的CIP對6株標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈平均直徑為15.57～21.71 mm，5株大腸桿菌分離株對4 μg/mL和8 μg/mL的CIP均表現(xiàn)出高度耐藥性。

2.3 SCD的最小抑制濃度和最低殺菌濃度

SCD對12株供試菌均具有抑制作用，12株菌的MIC和MBC范圍分別為0.06～0.50 mg/mL和0.13～2.00 mg/mL（表4）。

2.4 SPF雞感染大腸桿菌模型構(gòu)建

雞感染大腸桿菌后的死亡時(shí)間和死亡率結(jié)果見圖1。雞感染大腸桿菌后出現(xiàn)一系列相應(yīng)癥狀，包括體溫升高、精神萎靡、食欲不振、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)死亡，空白對照組無相應(yīng)癥狀。接種4×108 cfu/mL大腸桿菌的雞在6 h后開始出現(xiàn)癥狀，12 h后開始死亡，在感染72 h內(nèi)全部死亡。接種0.25×108 cfu/mL大腸桿菌的雞在24 h才顯示出明顯癥狀，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)共有6例死亡。經(jīng)計(jì)算，得出雞對該株大腸桿菌的LD50為1.23×108 cfu/mL。因此，感染試驗(yàn)選用感染劑量為2×108 cfu/mL，使用該劑量6 h內(nèi)出現(xiàn)明顯癥狀，發(fā)病率為100%，死亡率約80%。

2.5 體內(nèi)抑菌活性的測定

SCD在96 h內(nèi)對大腸桿菌感染雞的治療效果如圖2所示?？瞻讓φ战M未見發(fā)病或死亡，單獨(dú)攻菌組死亡率高達(dá)78%，口服SCD后死亡率顯著降低。

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等是人類和畜牧生產(chǎn)中常發(fā)病原菌，抗生素仍是治療細(xì)菌感染的主要選擇，但多重耐藥病原微生物的出現(xiàn)對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)構(gòu)成了巨大威脅[2]，因此，急需開發(fā)新一代抗菌藥物。五味子是一種常用中藥，其水提物中含有多種生物活性物質(zhì)，現(xiàn)已分離出30多種，并有不同程度的表征[12， 13]。藥理學(xué)研究揭示這些化合物具有多種治療效果，可抵抗多種病癥，包括炎癥、脂肪肝、肝炎、人類免疫缺陷病毒和焦慮等[13， 14]。

在本研究測試的致病菌中，SCD對革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌有更強(qiáng)的抑制作用。1.0 mg/mL SCD對細(xì)菌菌株的抗菌作用顯著強(qiáng)于8 μg/mL CIP，且SCD對耐藥性大腸桿菌的抑制作用同樣顯著。大腸桿菌病是家禽養(yǎng)殖中最常見的疫病之一，目前大腸桿菌野外分離菌株中對常規(guī)抗生素的耐藥率越來越高，多重耐藥菌越來越普遍[15]，對畜牧生產(chǎn)和人類健康構(gòu)成重大威脅，開發(fā)不基于抗生素的新治療方法具有現(xiàn)實(shí)緊迫性。本研究中，SCD在試驗(yàn)期內(nèi)顯著降低了相關(guān)病癥的發(fā)生，提高了感染雞的存活率。

綜之，SCD在體外和體內(nèi)均具有廣譜抑菌活性，可作為治療由常見病原菌引起傳染病的新型高效治療劑，但需要進(jìn)一步研究、鑒定發(fā)揮作用的主要活性成分并探索潛在的分子機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)：

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