徐達,梅漫莉,徐慶陽1,2,*

1(代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津,300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津,300457)3(天津科技大學 生物工程學院，天津,300457)

L-纈氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，屬于分支鏈氨基酸，是用來合成各類抗體、激素以及酶等的原料，在人體內有特殊的生理功能，是維持生命活動的重要物質[1-2]。任何高級生物都必須通過外源攝取的途徑來補充L-纈氨酸，因此，L-纈氨酸在氨基酸生產中具有重要地位[3-4]。在工業(yè)生產中，通常是以谷氨酸棒狀桿菌作為生產菌株，利用微生物發(fā)酵的方法生產L-纈氨酸[5-10]。L-纈氨酸通常作為營養(yǎng)增補劑添加至各類綜合氨基酸輸液及制劑中，其市場需求量呈逐年上升趨勢，然而，目前發(fā)酵法生產L-纈氨酸的產量仍未達到理想水平，無法滿足龐大的市場需求[11-12]。

膽堿[13]是所有生物膜的組成成分，同時作為乙酰膽堿的前體物質，它在各類生物體的生長發(fā)育中均起到了非常重要的調控作用，目前，氯化膽堿的添加在魚類養(yǎng)殖[14]、作物保護[14]、畜禽類增產[15-17]的方面皆起到了明顯的作用。在生物體內，重金屬修飾、基因表達的調控、蛋白質功能的調節(jié)以及RNA的加工都需要在酶的催化作用下進行甲基化才能實現[18-21]。一分子氯化膽堿攜帶3個活性甲基基團，在必要的時候能夠將甲基提供給高半胱氨酸，合成谷氨酸棒狀桿菌生長所必須的蛋氨酸，因此，氯化膽堿的外源添加對谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產L-纈氨酸必然會產生影響[21]。

為探究氯化膽堿在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產L-纈氨酸過程中的作用，本研究從添加方式以及添加量2個方面出發(fā)，旨在驗證外源添加氯化膽堿對于工業(yè)微生物菌體生長產酸是否具有促進作用，同時初步確定一種合適的添加方法，為谷氨酸棒狀桿菌工業(yè)化生產L-纈氨酸提供一個可行方案。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒狀桿菌XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)，天津科技大學代謝工程研究室保藏菌種。

1.2 主要儀器與設備

SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；5 L自動控制發(fā)酵罐,上海保興生物設備工程有限公司;30 L自動控制發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；KQ-C高壓蒸汽發(fā)生器，上海奉賢協新機電廠；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilents Technologies；Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5μm)，Agilents Technologies；HH-4恒溫水浴鍋，金壇市科學儀器廠；752分光光度計，上海分析儀器廠；SS-325全自動滅菌鍋，日本TOMY儀器有限公司；OLYMPUS生物顯微鏡，日本OLYMPUS會社；FA2204B電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)條件[22]

1.3.1 保藏條件

于-80 ℃環(huán)境下，2.8 mol/L的丙三醇溶液中保藏。

1.3.2 活化培養(yǎng)基

牛肉膏10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉10 g/L、玉米干粉10 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO51 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。121 ℃滅菌20 min，制成試管斜面培養(yǎng)基以及200 mL茄型瓶培養(yǎng)基。

1.3.3 種子培養(yǎng)基

葡萄糖30 g/L、KH2PO51.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L、VB10.3 mg/L、VH200 μg/L、玉米干粉20 g/L(121 ℃、20 min單獨滅菌)、豆粕水解液10 mL/L、酵母粉5 g/L、微量元素混合液1 mL/L、蛋氨酸1 g/L，115 ℃滅菌15 min。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖80 g/L、KH2PO52.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.8 g/L、VB10.2 mg/L、VH50 μg/L、玉米干粉16 g/L(121 ℃、20 min單獨滅菌)、豆粕水解液20 mL/L、微量元素混合液1 mL/L、谷氨酸5 g/L、亮氨酸 0.22 g/L、異亮氨酸 0.1 g/L、蛋氨酸 0.7 g/L。115 ℃滅菌15 min。

1.4 培養(yǎng)方法[22]

1.4.1 種子活化培養(yǎng)方法

將保藏于-80 ℃甘油管中的菌種涂布于試管斜面中，于32 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h；利用接菌環(huán)將試管斜面上的菌落涂布于茄型瓶中，于32 ℃擴大培養(yǎng)24 h。

1.4.2 種子罐培養(yǎng)方法

用無菌水將茄型瓶中的菌體洗脫下來，接種于5 L發(fā)酵罐中并最終定容至3 L進行種子培養(yǎng)，溫度32 ℃，初始轉速200 r/min，通風量2.0 L/min，通過自動流加氨水控制pH 7.0～7.2,以泡敵消泡,通過溶氧反饋調節(jié)轉速，使得溶氧水平保持在20%～30%，培養(yǎng)14 h左右，菌體生長至OD600為22時接種2.5 L體積于30 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。

1.4.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)方法

定容至13 L，溫度32 ℃，初始轉速200 r/min，通風量0.5 m3/h，通過自動流加氨水控制pH維持7.0～7.2，以泡敵消泡，通過溶氧反饋調節(jié)轉速，維持罐內溶氧水平于20%左右，通過一定脈沖比進行流加補糖，控制發(fā)酵液內殘?zhí)菨舛缺３衷?0～15 g/L，培養(yǎng)時間52 h。

1.4.4 氯化膽堿梯度添加控制發(fā)酵

以氯化膽堿添加量作為變量，在不同批次發(fā)酵培養(yǎng)基底物中分別添加質量濃度為0、0.3、0.5、1、2 g/L的氯化膽堿進行培養(yǎng)，選擇最優(yōu)的濃度，在此基礎上采取氯化膽堿隨糖流加的方式，同時選擇在不同批次的流加糖中添加質量濃度為0、0.3、0.5、1、2 g/L的氯化膽堿進行對比實驗。

1.5 分析測定方法[23-25]

每間隔4 h取樣，用去離子水稀釋樣品20倍，在600 nm波長下測定分光光度值，離心取上清液，利用SBA生物傳感分析儀測定發(fā)酵液內的殘?zhí)?；電子天平稱重并記錄每4 h流加補糖的量；梅特勒電極在線實時監(jiān)測pH、DO、溫度，精密pH試紙(6.4～8.0)輔助矯正pH。高效液相色譜法分析測定氨基酸含量，采用Agilent C18色譜柱，衍生劑為2，4-二硝基氟苯，柱前衍生，有機相為50%的乙腈、無機相為4.1 g/L的乙酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm。

1.6 數據分析

所有試驗數據取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后Dunnett檢驗來確定數據差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 底物中氯化膽堿的不同添加量對發(fā)酵菌體量及產酸的影響

如圖1和圖2所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基底料中添加了5個不同質量濃度的氯化膽堿,測定了菌體在生長過程中的密度變化以及產量增長。隨著底物中氯化膽堿添加量的增加，菌體生長速度也隨之增加，當底物中氯化膽堿添加質量濃度提高至0.5 g/L以上時，菌體生長速率變化不明顯，所有濃度添加下，最終菌體總量趨于一致，菌液最高OD600nm達到39.56；隨著底物中氯化膽堿添加濃度的增加，L-纈氨酸的產量也隨之增加，當氯化膽堿添加量提高至0.5 g/L以上時，L-纈氨酸產量隨氯化膽堿添加量變化不明顯，最終維持在76 g/L左右。

圖1 不同氯化膽堿添加量對菌體OD影響Fig.1 The value of optical density under different contents of choline chloride

圖2 不同氯化膽堿添加量對L-纈氨酸產量的影響Fig.2 the production of L-valine under different contents of choline chloride

2.2 底物中氯化膽堿的不同添加量對菌體耗糖與糖酸轉化率的影響

在發(fā)酵結束之后，對不同氯化膽堿添加量的批次進行耗糖速率與糖酸轉化率的測算，繪制耗糖速率曲線，見圖3。隨著底物中氯化膽堿添加量的增加，菌體耗糖速率加快，當底物中氯化膽堿添加量提高至0.5 g/L以上時，耗糖速率不再隨著氯化膽堿添加量增加而大幅增加，而是趨于穩(wěn)定；如表1所示，氯化膽堿添加量的不同對菌體糖酸轉化率的提高沒有很明顯的作用，糖酸轉化率依舊保持在36%左右。

圖3 不同氯化膽堿添加量對菌體耗糖的影響Fig.3 the glucose consumption under different contents of choline chloride

表1 不同氯化膽堿添加量下的糖酸轉化率Table 1 conversion rate of glucose and acid under different contents of choline chloride

注：表中累計耗糖量為已除去所含結晶水和溶劑水的葡萄糖含量。下同。

2.3 聯合流加補充氯化膽堿的不同添加量對發(fā)酵菌體量及產酸的影響

為探究是否在整個發(fā)酵過程中保持罐內氯化膽堿濃度在一定值時最有利于發(fā)酵產酸及糖酸轉化率的提高，我們在發(fā)酵中期開始補糖的時候進行隨糖流加一定濃度的氯化膽堿，并且同樣選擇了0、0.3、0.5、1、2 g/L五個質量濃度的添加量，對比發(fā)酵過程中的菌體生長密度變化以及目的氨基酸產物的增長狀況(圖4、圖5)。發(fā)現，隨著氯化膽堿添加量的增加，菌體活力提高，菌體增長速度加快，當隨糖流加的氯化膽堿濃度達到1 g/L時，菌體增速達到峰值；L-纈氨酸的產量與氯化膽堿的流加濃度呈正比，當隨糖流加的氯化膽堿質量濃度達到1 g/L時，L-纈氨酸的產量也達到峰值，此時增加所流加氯化膽堿的濃度時，L-纈氨酸產量沒有明顯提高，基本維持在86 g/L左右。

圖4 不同氯化膽堿流加量對菌體OD的影響Fig.4 the value of optical density under different fed-batch contents of choline chloride

圖5 不同氯化膽堿流加量對L-纈氨酸產量的影響Fig.5 the production of L-valine under different fed-batch contents of choline chloride

2.4 聯合流加補充氯化膽堿的不同添加量對菌體耗糖與糖酸轉化率的影響

對不同濃度流加氯化膽堿的發(fā)酵批次進行耗糖速率以及糖酸轉化率的統計測算，繪制曲線圖表，如圖6、表2所示。菌體的活力與流加氯化膽堿的濃度成正比，當隨糖流加的氯化膽堿質量濃度達到1 g/L時，菌體耗糖速率達到峰值；與在底糖中添加氯化膽堿情況相似，菌體發(fā)酵的最終糖酸轉化率沒有較大地提高，依舊穩(wěn)定在36%左右(表2)。

圖6 不同氯化膽堿流加量對菌體耗糖的影響Fig.6 the glucose consumption under different contents of choline chloride

2.5 氯化膽堿的添加對單位菌體產酸速率的影響

對未添加氯化膽堿的發(fā)酵批次與添加最適濃度的氯化膽堿的發(fā)酵批次進行對比，計算其單位菌體每小時的產酸，繪制曲線，如圖7所示，氯化膽堿最適添加量下的發(fā)酵批次中，每個時間點的單位菌體產酸速率均高于未進行添加的發(fā)酵批次，因此可見，氯化膽堿的添加有效提高了菌體的活力和產酸能力。

圖7 優(yōu)化前后單位菌體產酸對比Fig.7 Comparison of acid production per gram of bacteria before and after optimization

膽堿作為甲基供給的前體物，是參與磷脂、卵磷脂合成的重要物質，同時還是乙酰膽堿的前體物，在調節(jié)細胞生命活動中起著非常重要的作用[26-27]。在畜禽、水產等養(yǎng)殖行業(yè)中向動物飼料中添加適量的氯化膽堿，能夠有效提高產品產量與質量，而在微生物的培養(yǎng)過程中，氯化膽堿的實際應用相對較少[28]。研究表明，氯化膽堿作為卵磷脂的重要合成物質，對微生物細胞膜的合成有著較大的影響，而細胞膜的合成對菌體生長的速度有著限制性的作用，在細胞膜合成不足的情況下，菌體生長速率必然受到限制，提供足夠的氯化膽堿有利于菌體細胞膜的合成，進而提高菌體生長速率[28]；作為多甲基供體，氯化膽堿能夠提供微生物生長代謝過程中多種甲基化反應所需的活性甲基，當菌體生長過程中營養(yǎng)供應不足或出現轉甲基反應上調時，甲基群可能成為限制性因素，這些情況會影響甲硫氨酸在蛋白質合成中的有效性，從而降低生長速度，此時，氯化膽堿作為甲基供體可以有效緩解這種情況，提高菌體生長速率[26]；作為一種滲透保護劑，氯化膽堿能夠調節(jié)細胞的滲透壓，減少菌體生長過程中的應激反應，穩(wěn)定菌體內酶的活性以及生物大分子的功能，從而減弱因環(huán)境因素的變化對菌體活力造成的負面影響，使得菌體活力能夠維持在一個較高的水平[29]；作為一種參與細菌熱保護作用的物質，氯化膽堿能夠保護檸檬酸合成酶不受熱變性影響，并刺激其復性，保護了三羧酸循環(huán)，使菌體在生長方面表現出更強的穩(wěn)定[30]。

在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產L-纈氨酸過程中適量添加氯化膽堿，有效加快了菌體的生長速率，但由于發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長所需的廣泛類營養(yǎng)元素如磷鹽等的總量控制在同一水平，所有批次的發(fā)酵實驗中，最終菌體的總量也都維持在同一水平。從實驗中可以看出，L-纈氨酸產量幅增的原因主要有2點：(1)氯化膽堿的添加使得菌體的生物量提前達到峰值，單位菌體產酸不變的情況下，菌體總量提高，L-纈氨酸單位時間內產酸勢必增加，這與本研究實驗結果相符；(2)氯化膽堿的添加使得菌體內各類酶以及生物大分子的活性增強，菌體耗糖速率增加，在后期菌體總量一致的情況下，單位菌體單位時間轉化葡萄糖的速率增大，從而導致L-纈氨酸的產量增加，與本研究實驗結果相符。氯化膽堿的添加對于提高菌體生長速率以及產酸速率方面有著顯著效果，使產酸高峰期提前，壓縮了整個發(fā)酵周期，與優(yōu)化前發(fā)酵實驗相比較，優(yōu)化后批次發(fā)酵進行至40 h產酸即達到前者進行至52 h時的水平，極大地提高了發(fā)酵的效率。同時，本研究的結果為谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產L-纈氨酸在高密度菌體發(fā)酵方面的研究提供了思路，同時也為縮短L-纈氨酸發(fā)酵生產周期提供了方案。

3 結論

氯化膽堿的外源添加能夠有效增強菌體的活力，加快菌體生長，提高菌體產酸速率。本研究通過對氯化膽堿的添加量以及添加方式進行探索，確定了谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產L-纈氨酸過程中添加氯化膽堿的一種有效方式以及添加量；實驗表明，當在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產L-纈氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基底物中添加0.5 g/L的氯化膽堿，同時在發(fā)酵過程中隨糖流加1 g/L濃度的氯化膽堿，能夠有效提高菌體活力，加快菌體生長以及產酸速率，經過52 h的發(fā)酵培養(yǎng)，L-纈氨酸產量最終達到86.2 g/L，較添加前的產量提升了26.4%，糖酸轉化率穩(wěn)定在36%左右。