史紅玲,陳夢言,劉飛,唐存多,劉鉞,姚倫廣*,闞云超*

1(南陽師范學(xué)院 昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室和河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽,473061)2(南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 南陽,473061)3(車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽,473000)

進(jìn)入新世紀(jì)以來，全球經(jīng)濟(jì)經(jīng)歷了飛速發(fā)展的階段，而環(huán)境污染和能源危機(jī)的形勢卻日益嚴(yán)峻[1-2]。隨著人們生活水平日益提高，含油脂生活廢水的排放也呈指數(shù)增長[3]。未經(jīng)處理直接進(jìn)入水體的油脂會(huì)漂浮于水體表面，影響水體的富氧及后續(xù)凈化，危害水生生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重污染周圍環(huán)境[4-5]。目前，含油脂廢水的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法和化學(xué)法由于投資大、占地廣、工藝復(fù)雜，且容易產(chǎn)生二次污染，實(shí)際應(yīng)用較少[5]。生物法處理油脂廢水，主要利用油脂廢水中具有一定的油脂降解能力的微生物，將油脂作為碳源和能源，并通過微生物生長過程中產(chǎn)生的脂肪酶等降解酶系將油脂水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為H2O和CO2等代謝產(chǎn)物[6]。生物處理過程投資小、成本低、效率高且無二次污染，現(xiàn)已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[7-9]，降解油脂微生物的篩選分離也逐漸成為了研究熱點(diǎn)[10]。

目前，丹江口庫區(qū)的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和轉(zhuǎn)型升級(jí)得到了大力發(fā)展，來自工業(yè)的三廢污染和農(nóng)業(yè)的面源污染已得到了良好控制[11-12]。然而，庫區(qū)人們?nèi)找嬖鲩L的生活廢棄油脂排放，若不及時(shí)處理，一旦超過水體自凈的閾值，必將成為新增的污染源。本研究以丹江口庫區(qū)廣泛使用的大豆油為模式底物，從丹江口庫區(qū)上游支流紫氣河的水體中，篩選出了能夠高效降解當(dāng)?shù)厣顝U棄油脂的土著微生物，為實(shí)現(xiàn)丹江口庫區(qū)廢棄生活油脂的生物降解奠定了基礎(chǔ)，對(duì)庫區(qū)的污水生物處理及水生態(tài)安全的保護(hù)也具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣

在丹江口庫區(qū)的馬蹬鎮(zhèn)紫氣河流域，根據(jù)生活污水的排放特點(diǎn)，選取了3個(gè)合適的采樣點(diǎn)，分別用無菌的50 mL離心管采取水樣，于冰盒保存?zhèn)浜Y。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)液、中性紅培養(yǎng)基及選擇培養(yǎng)液參照孟靜[10]的方法，根據(jù)當(dāng)?shù)厥秤糜褪褂玫奶攸c(diǎn)略作修改。富集培養(yǎng)液：NaCl 5 g，蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，福臨門大豆油4 mL，自然pH，用水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min；油脂中性紅培養(yǎng)基：NaCl 5 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO41.5 g，(NH4)2SO41.0 g，瓊脂20 g，Tween 80 20 mL，福臨門大豆油10 mL，1.6%中性紅水溶液1 mL，蒸餾水定容至1 L，自然pH，121 ℃滅菌20 min；選擇培養(yǎng)液：蛋白胨1 g，NH4NO30.2 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1g，豆油1 mL，pH 7.2～7.4，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑與試劑盒

Axygen?AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit，Axygen公司；Premix Prime STAR HS試劑盒，大連寶生物；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 油脂降解菌的馴化

將采集的水樣樣品充分混合，取5 mL加入裝有45 mL無菌水和無菌玻璃組的150 mL三角瓶內(nèi)，置于搖床上，200 r/min轉(zhuǎn)速充分振蕩10 min，然后取5 mL加入35 mL富集培養(yǎng)液中，并在40 ℃，200 r/min，自然pH條件下培養(yǎng)，每天觀察，如果發(fā)現(xiàn)油脂降解得好就補(bǔ)加少量大豆油，每4 d轉(zhuǎn)接10 mL培養(yǎng)物至30 mL新的培養(yǎng)基中，以促進(jìn)油脂降解菌的生長，此馴化過程持續(xù)2個(gè)月。

1.3 油脂降解菌的篩選

1.3.1 初篩

將馴化后的菌液梯度稀釋后涂布于油脂中性紅培養(yǎng)基上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行平板培養(yǎng)，每12 h觀察培養(yǎng)基中菌落的生長情況。在相同培養(yǎng)條件下生長的菌株，單菌落生長的比較大而且顏色鮮紅，則證明該菌株能在此條件下良好地生長，且具有降解油脂的能力，從而初步測定出各菌株對(duì)油脂的降解情況，并以此來判斷待測菌株對(duì)油脂的降解能力。

1.3.2 復(fù)篩

參照張印等[13]方法，采用紫外分光光度法測定油脂降解率，來對(duì)油脂降解菌進(jìn)行復(fù)篩，獲得油脂降解能力最強(qiáng)的菌株，并進(jìn)行編號(hào)命名，以供下一步的鑒定。

1.3.3 油脂降解率的測定

將大豆油溶解于石油醚，配制成10%的標(biāo)準(zhǔn)液，然后分別用石油醚配制成體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、4%和5%的工作液。然后在205 nm處測定各濃度下油脂的OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。通過方程式(1)計(jì)算油脂降解率。

(1)

式中:C0,培養(yǎng)基中含油量;C1,發(fā)酵液中含油量。

1.4 油脂降解菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)和生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，將目標(biāo)菌株進(jìn)行形態(tài)和生理生化特征鑒定。

1.4.2 目的菌株的16 S rDNA的擴(kuò)增及分析

細(xì)菌基因組DNA的提取參照試劑盒的說明書進(jìn)行，并用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)測基因組的濃度。利用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F和1492R，以目的菌種基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程有限公司測序，將得到的16S rDNA序列結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行BLAST比對(duì)，找到并下載典型的菌株序列與實(shí)驗(yàn)菌株的序列用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行同源性分析，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 油脂降解條件的研究

1.5.1 初始pH的影響

丹江口庫區(qū)水體的pH值一般在7.8～8.2[14]，為了考察不同的初始pH值對(duì)油脂降解的影響以及目標(biāo)菌株對(duì)庫區(qū)pH的適應(yīng)性，本文首先對(duì)初始pH值做了單因素分析。以選擇培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，調(diào)整油脂初始濃度到5%，菌種接種量10%，分別選定pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0作為初始值，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，然后分別測定各pH值下的油脂降解率。

1.5.2 培養(yǎng)時(shí)間的影響

為了考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)油脂降解情況的影響，以選擇培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，調(diào)整油脂初始濃度到5%，菌種接種量10%，pH值為7.0，在37 ℃、150 r/min下分別培養(yǎng)0、6、12、18、24、30和36 h，然后分別測定各培養(yǎng)時(shí)間線下的油脂降解率。

1.5.3 培養(yǎng)溫度的影響

丹江口庫區(qū)水體的水溫常年在6～27 ℃[14]，為了考察不同的培養(yǎng)溫度對(duì)油脂降解的影響以及目標(biāo)菌株對(duì)庫區(qū)溫度的適應(yīng)性，本文也對(duì)溫度做了單因素分析。以選擇培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，調(diào)整油脂初始濃度到5%，菌種接種量10%，pH值為7.0，分別在5、10、15、20、25、30和35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，然后分別測定各溫度下的油脂降解率。

1.5.4 目標(biāo)菌株對(duì)其他常見油脂的降解

丹江口庫區(qū)居民的生活油脂主要包括大豆油、菜籽油和花生油，為了進(jìn)一步考察目標(biāo)菌株的應(yīng)用潛力，本文繼續(xù)考察了目標(biāo)菌株對(duì)菜籽油和花生油的降解效果。以選擇培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，分別調(diào)整菜籽油和花生油初始濃度到5%，菌種接種量10%，pH值為7.0，在35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，每隔4 h取樣測定它們的油脂降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 油脂降解菌的馴化與分離篩選

用大豆油對(duì)菌種進(jìn)行為期2個(gè)月的馴化，然后用中性紅油脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板分離，獲得了一株油脂降解能力較強(qiáng)的菌株。如圖1所示，1號(hào)菌株的菌落周圍有明顯的水解圈，且明顯大于其他菌落，另外菌落中間也有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)，表明該菌株水解油脂的潛力較大[10,15-16]，命名為NY-201801。用紫外吸收測定油脂降解率的方法進(jìn)行復(fù)篩，測得NY-201801菌株對(duì)5%油脂的水解率能達(dá)到50%以上，進(jìn)一步證實(shí)該菌的確具有降解油脂的能力。

圖1 生活油脂降解菌的平板分離Fig.1 Plate isolation of degrading household lipid

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征及生理生化鑒定

NY-201801菌株為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落呈圓形，菌落表面在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上遷徙生長。生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 NY-201801菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of NY-201801

注：“+”表示具備此特征；“-”表示不具備此特征。

結(jié)果表明該菌株具有尿素酶活性，沒有β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，能夠分解含硫有機(jī)物生成，其生理生化特性與孟靜等[10]報(bào)道的變形桿菌較為類似。利用高分辨率場發(fā)射掃描電鏡對(duì)NY-201801菌株進(jìn)行電鏡分析，結(jié)果如圖2所示。菌體長度約1 μm、直徑約0.4 μm，鞭毛少且短。

圖2 NY-201801菌株的場發(fā)射掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 Field emission scanning electron microscope photograph of NY-201801

2.2.2 16 S rDNA測序鑒定

NY201801菌株經(jīng)過16S rDNA測序(Accession No.:MK392127)，將序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，用ClustX 2.0和Mega 6.0軟件繪制菌株NY-201801系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。結(jié)果表明菌株NY-201801與Proteusmirabilisstrain FC2969相似度達(dá)到99.9%，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，可以初步鑒定為NY-201801菌株為Proteusmirabilis[10]。

圖3 菌株NY-201801系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain NY-201801

2.3 油脂含量與OD205的相關(guān)性

為了考察油脂含量與OD205的線性關(guān)系，本研究分別測定了0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、4%和5%大豆油在205 nm下的紫外吸收值。利用Origin 9進(jìn)行線性擬合，曲線如圖4所示。

圖4 油脂含量與OD205的相關(guān)性Fig.4 The correlation between oil content and OD205

結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 8，表明在油脂濃度為0.5%～5%，油脂濃度與OD205成良好的線性相關(guān)，利用紫外吸收法能夠準(zhǔn)確地測定油脂的濃度。

2.4 pH值對(duì)油脂降解率的影響

為了考察ProteusmirabilisNY-201801菌株對(duì)丹江口庫區(qū)水體pH的適應(yīng)能力，本研究首先研究了不同pH值對(duì)油脂降解率的影響，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，該菌株在庫區(qū)水體pH值范圍內(nèi)[14]，對(duì)油脂的降解率均能達(dá)到90%以上，顯著高于前人報(bào)道的水平[3,17]。同時(shí)，該菌株對(duì)庫區(qū)水體pH值具有良好的適應(yīng)能力，也意味著它在降解庫區(qū)生活油脂方面具有更大的應(yīng)用潛力。在低pH值下，ProteusmirabilisNY-201801對(duì)油脂的降解率較低，可能原因?yàn)樵摼a(chǎn)生的脂肪酶的最適pH值偏堿性，在低pH值下不利于脂肪酶發(fā)揮水解作用。而且油脂的水解本身也是一個(gè)產(chǎn)酸的過程，故較高的初始pH值更利于反應(yīng)的進(jìn)行。

圖5 pH對(duì)降解率的影響Fig.5 The effect of pH on degradation rate

2.5 時(shí)間對(duì)油脂降解率的影響

為了考察ProteusmirabilisNY-201801對(duì)油脂的降解效率，研究了不同反應(yīng)時(shí)間下的油脂降解率，結(jié)果如圖6所示。前6 h處在菌體生長和脂肪酶的積累時(shí)期，油脂降解率增加的趨勢較緩，隨著時(shí)間的延長，油脂降解率逐漸提升，到36 h時(shí)降解率達(dá)到95%。與前人的研究相比，在相同的菌種添加量、初始油脂濃度及作用時(shí)間等條件下，ProteusmirabilisNY-201801對(duì)油脂的降解率明顯占優(yōu)勢[9-10]，也表明它具有更大的應(yīng)用前景。

圖6 時(shí)間對(duì)降解率的影響Fig.6 The effect of time on degradation rate

2.6 溫度對(duì)油脂降解率的影響

為了考察ProteusmirabilisNY-201801菌株對(duì)丹江口庫區(qū)水體水溫的適應(yīng)能力，本研究考察了不同溫度對(duì)油脂降解率的影響，結(jié)果如圖7所示。在庫區(qū)水體溫度6～27 ℃，溫度越高，油脂的降解率也越高。這歸因于溫度能夠正調(diào)節(jié)微生物的生長速率、脂肪酶的活性，以及油脂在水中的溶解度及擴(kuò)散能力。在菌體合適的生長溫度(35 ℃)下，降解率可以高達(dá)92%；在夏季平均水溫(25 ℃)下，ProteusmirabilisNY-201801對(duì)油脂的降解率可以達(dá)到50%以上；在10 ℃時(shí)，還有一定的降解能力；溫度低于最低水溫(5 ℃)時(shí)，對(duì)油脂幾乎沒有降解能力。進(jìn)一步表明，來源于丹江口庫區(qū)的土著微生物ProteusmirabilisNY-201801對(duì)庫區(qū)的環(huán)境具有良好的適應(yīng)能力，在處理庫區(qū)生活廢棄油脂時(shí)較其他微生物更具優(yōu)勢。

圖7 溫度對(duì)降解率的影響Fig.7 The effect of temperature on degradation rate

2.7 Proteus mirabilis NY-201801對(duì)其他油脂的降解

為了進(jìn)一步考察ProteusmirabilisNY-201801菌株的應(yīng)用潛力，圍繞丹江口庫區(qū)居民日常生活油脂的使用特點(diǎn)，本研究繼續(xù)考察了ProteusmirabilisNY-201801菌株對(duì)菜籽油和花生油的降解效果，菌種接種量10%，pH值為7.0，在35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，降解率隨時(shí)間的變化如圖8所示。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)初期，ProteusmirabilisNY-201801菌株對(duì)花生油和菜籽油的降解較快，可能歸因于ProteusmirabilisNY-201801菌株中水解花生油和菜籽油的脂肪酶水平較高，在初期降解花生油和菜籽油的效果較好。12 h后，ProteusmirabilisNY-201801菌株對(duì)大豆油的降解率有顯著提高，可能歸因于這一段時(shí)間內(nèi)偏愛大豆油的脂肪酶得以大量表達(dá)，表現(xiàn)出了對(duì)大豆油更強(qiáng)的降解能力。當(dāng)培養(yǎng)至36 h，ProteusmirabilisNY-201801菌株對(duì)3種供試油脂均有較好的降解效果，降解效果最好的大豆油的降解率可達(dá)90%以上，效果最差的花生油的降解率也接近70%，表明ProteusmirabilisNY-201801菌株具有較好的油脂種類的普適性，具有較大的應(yīng)用潛力。

圖8 Proteus mirabilis NY-201801對(duì)不同油脂的降解效率Fig.8 The degradation efficiency of Proteus mirabilis NY-201801 for different oils

3 討論

隨著生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，人們對(duì)油脂的消耗量日益增長，過多的生活廢棄油脂進(jìn)入水系，會(huì)降低水系的自凈能力、破壞水生生態(tài)系統(tǒng)[5]。在南水北調(diào)中線工程干渠通水以后，進(jìn)入庫區(qū)參觀的游客日益增多，顯著增加了庫區(qū)餐廚垃圾的排放，增加了水體自凈的壓力。生活油脂大多為長鏈的甘油三脂，油脂的生物降解主要依賴于微生物產(chǎn)生的脂肪酶來逐漸水解成短鏈的脂肪酸和甘油[15]。篩選高效的油脂降解菌對(duì)生活油脂進(jìn)行回收和利用，已成為許多科研工作者所關(guān)注的焦點(diǎn)[10,18-19]。

土著微生物對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境具有更好的適應(yīng)性，在環(huán)境治理和生態(tài)修復(fù)方面也具有更大的優(yōu)勢和應(yīng)用潛力[20-21]。本研究利用大豆油為目標(biāo)底物對(duì)庫區(qū)紫氣河水中的微生物進(jìn)行馴化，然后利用中性紅油脂平板篩選出了一株具有較強(qiáng)油脂降解能力的土著微生物NY-201801，油脂降解能力明顯優(yōu)于已報(bào)道的微生物[6,18-19]。同時(shí)該菌也具有巨大的挖掘高活性脂肪酶的潛力，有待下一步深入研究。經(jīng)生理生化和分子鑒定，NY-201801與Proteusmirabilis的相似性最高[10]，16S rDNA的序列同源性高達(dá)99.9%，故將其命名為ProteusmirabilisNY-201801。

此外，考察了pH值對(duì)ProteusmirabilisNY-201801降解油脂效率的影響，結(jié)果顯示該菌株對(duì)庫區(qū)水體pH值良好適應(yīng)能力，在庫區(qū)水體pH值范圍內(nèi)對(duì)油脂均具有較高的降解率，也意味著它在降解庫區(qū)生活油脂方面具有更大的應(yīng)用潛力，進(jìn)一步體現(xiàn)了土著微生物在治理當(dāng)?shù)丨h(huán)境中的優(yōu)勢。同時(shí)，考察了溫度對(duì)油脂降解率的影響，ProteusmirabilisNY-201801對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性較廣，在15 ℃下反應(yīng)36 h仍能達(dá)到40%的降解率，能夠適應(yīng)庫區(qū)大部分時(shí)間的水溫，較其他已報(bào)道的菌株更具應(yīng)用優(yōu)勢。但該菌株在5 ℃對(duì)油脂幾乎沒有降解能力，也有可能是低溫下菌株不能良好的生長，也有可能是產(chǎn)生的脂肪酶在低溫下活性極低，有待下一步的驗(yàn)證和改造。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)丹江口庫區(qū)生活油脂的特點(diǎn)，對(duì)紫氣河流域的油脂降解微生物進(jìn)行了馴化、篩選和鑒定，并對(duì)油脂降解的條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，得出了如下結(jié)論：

(1)從丹江口庫區(qū)紫氣河流域篩選到了一株能夠高效水解大豆油的微生物，編號(hào)為NY-201801，經(jīng)鑒定該菌株的生理生化特征及16S rDNA序列與奇異變形桿菌Proteusmirabilis最為接近，故將其命名為ProteusmirabilisNY-201801。

(2)ProteusmirabilisNY-201801具有較強(qiáng)的油脂降解能力，5%油脂初始濃度，菌種接種量10%，pH值為7.0，在35 ℃、150 r/min下培養(yǎng)36 h，油脂降解率可以達(dá)到92%。

(3)ProteusmirabilisNY-201801能夠較好地適應(yīng)丹江口庫區(qū)水體的pH值和溫度等條件，具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，在庫區(qū)最高水溫的條件下，對(duì)5%油脂的降解率可以達(dá)到50%，同時(shí)ProteusmirabilisNY-201801對(duì)菜籽油及花生油也具有較好的降解效果，具有較大的應(yīng)用前景。