孫宏浩，馬正虎，秦湯，趙曉雙

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，教育部發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“111”細(xì)胞調(diào)控與分子藥物學(xué)科創(chuàng)新引智基地，武漢 430068)

鹽酸阿霉素(DOX)作為治療實(shí)體瘤最為有效的藥物之一，在臨床上通常被用來治療多種類型癌癥，如急性白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等[1,2].但是，藥物對作用部位生物利用度低，特異靶向性差，導(dǎo)致化療效果不理想[3,4]，且具有全身毒副作用[5]，極大地限制了藥物的治療劑量[6].此外，傳統(tǒng)單一抗癌治療法對腫瘤組織的滲透和轉(zhuǎn)移及多重耐藥性(MDR)腫瘤細(xì)胞系等情況治療效果較差[7].為克服這些困難，出現(xiàn)了多重治療策略協(xié)同作用的新型納米載體與藥物輸送系統(tǒng)(DDS)相結(jié)合的治療方法，探索更安全、更有效、更方便的藥物控制釋放系統(tǒng)，研發(fā)多功能納米粒子并將其作為傳遞藥物的重要載體，是未來癌癥治療關(guān)注的焦點(diǎn).

作為一種與化療協(xié)同治療腫瘤的手段，光熱療法可以改變細(xì)胞膜的流動性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的通透性，使DOX容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并保持較高的藥物濃度，顯著提高腫瘤的治療效果[8,9].近年來，作為微創(chuàng)抗癌治療策略之一，近紅外激光用于熱療(PTT)獲得越來越多的關(guān)注，并在腫瘤治療中廣泛應(yīng)用.金納米棒具有良好的生物相容性和高的光熱轉(zhuǎn)換效率,在基于PTT的腫瘤治療中是理想的光治療劑[10-14].

本文合成了一種新型的多層結(jié)構(gòu)的多功能納米載體GNR@SiO2-DOX@CouC12-HA (GSDCH)，有效用于PTT與化療協(xié)同治療腫瘤.以金納米棒為內(nèi)核，在金納米棒的表面包覆一層介孔二氧化硅(MSNs)用于載藥，MSNs具有均勻且可調(diào)諧的粒徑、孔徑及較大的比表面積和孔容積，其表面易于進(jìn)行功能化修飾且具有良好的生物相容性.將復(fù)合粒子羧基功能化之后通過靜電吸附作用載入DOX，帶有2個C12支鏈的溫敏性脂質(zhì)體和光敏性香豆素作為封堵劑和光控開關(guān)結(jié)合在納米粒子上.最后，在納米粒子表面修飾的透明質(zhì)酸(HA)使納米載體具有靶向于CD44受體過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的功能，且透明質(zhì)酸(HA)使得納米載體具有較好的膠體穩(wěn)定性.乳腺癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)能對GSDCH有更高效的細(xì)胞攝取，在808 nm近紅外激光照射下，金納米棒將光能轉(zhuǎn)換成熱能，智能光控開關(guān)被開啟并釋放出DOX，采用光熱療法協(xié)同治療腫瘤具有較好的治療效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

正硅酸四乙酯(CTAB)、正硅酸乙酯(TEOS)、硼氫化鈉(NaBH4)、5-溴水楊酸(5-BrSA)、抗壞血酸(AA)、濃鹽酸(HCl，35%)、氯金酸(HAuCl4)(上海化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(NaOH)、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；所有試劑均為分析純.透射電子顯微鏡(TEM，F(xiàn)EI Tecnai G220型，200 kV)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272型，上海一恒)；激光粒度分析儀(Zetasizer-Nano ZS型，英國馬爾文儀器).

1.2 納米載體的制備

1.2.1 GNRs的制備

取10.3 μL的氯金酸(10 mg/mL)和0.5 mL CTAB溶液(0.2 mol/L)混合均勻，攪拌下加入0.1 mL硼氫化鈉溶液(0.227 mg/mL)，攪拌30 s后于30 ℃下靜置，新配好的種子液務(wù)必在0.5～2 h內(nèi)使用.稱取1.8 g CTAB和0.22 g 5-溴水楊酸加入至100 mL圓底燒瓶中，隨后加入95 mL去離子水，將圓底燒瓶置于水浴鍋中60 ℃件下攪拌溶解，溶解完畢后，向其中加入3 mL硝酸銀溶液(4 mmol/L)和1 mL HCl溶液(1 mol/L)，將溶液冷卻至30 ℃.再向溶液中加入2.06 mL氯金酸(10 mg/mL)，30 ℃下靜置15 min，劇烈攪拌下加入0.4 mL抗壞血酸(0.064 mol/L)和80 μL先前配制的種子液，30 ℃下過夜.

1.2.2 GNR@SiO2的制備

取10 mL金納米棒的溶液(1 mg/mL)于38 ℃水浴鍋中，加入400 μL的氨水調(diào)節(jié)該溶液pH至10～11.取80 μL TEOS溶解到1.92 mL無水乙醇中，每隔0.5 h向金納米棒溶液中加入200 μL該溶液，直至滴加完畢，反應(yīng)48 h.反應(yīng)結(jié)束后將該溶液在10000 r/min條件下離心30 min，分散于15 mL鹽酸乙醇溶液[V(HCl)∶V(C2H5OH)=1∶9]，冰水浴中超聲30 min，重復(fù)以上操作3次，再用乙醇和水各洗滌1次后分散于10 mL乙醇中.

1.2.3 GNR@SiO2-COOH的制備

向10 mL介孔二氧化硅包埋的金納米棒復(fù)合材料(GNR@SiO2)的乙醇分散液，加入400 μL氨水，將溶液的pH調(diào)至約10，加入2 mL含有15 mg APTES-COOH的水溶液，室溫攪拌過夜.待反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)產(chǎn)物10000 r/min離心30 min，用乙醇和超純水分別洗滌2次，洗滌完畢后，將沉淀物分散于10 mL PBS中保存.

1.2.4 DOX的裝載

取10 mL羧基功能化的GNR@SiO2-COOH的PBS分散液(粒子質(zhì)量約為10 mg)，向其中加入2.4 mg鹽酸阿霉素(DOX)，室溫避光攪拌48 h，11000 r/min離心30 min至上清液無色透明，將沉淀物重新分散在10 mL超純水中保存.

1.2.5 GNR@SiO2-DOX@CouC12的制備

取20 mL載藥的羧基功能化的GNR@SiO2-DOX的水分散液，在室溫攪拌下加入100 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，15 min后加入30 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下攪拌.向該溶液中加入50 mg F127，攪拌10 min后，滴加2 mL含有30 mg烷基化羥甲基香豆素的氯仿溶液，攪拌形成乳液后，室溫攪拌過夜，產(chǎn)物用超純水離心(10000 r/min，30 min)洗滌2次，使用10 mL超純水分散保存.

1.2.6 GNR@SiO2-DOX@CouC12-HA的制備

取10 mL復(fù)合納米粒子的氯仿分散液，加入50 mL含有20 mg烷基化透明質(zhì)酸的水溶液，室溫下攪拌過夜.將產(chǎn)物用超純水離心(10000 r/min，30 min)洗滌3次，分散在10 mL超純水中保存.

1.3 APTES-COOH的制備

取2.5 g(25.5 mmol)馬來酸酐置于25 mL單口圓底燒瓶中，冰浴條件下逐滴加入5.5 mL(23.5 mmol)APTES，快速攪拌，直至反應(yīng)物變成白色膏狀固體，4 ℃下保存.

1.4 7-(雙十二烷基胺)-4-羥甲基香豆素的合成

7-(雙十二烷基胺)-4-羥甲基香豆素的合成路線圖見圖1.

圖1 7-(雙十二烷基胺)-4-羥甲基香豆素的合成路線

1.4.1 7-氨基-4甲基香豆素的合成

參照文獻(xiàn)[16]，合成7-氨基-4甲基香豆素(AMC).稱取11 g間氨基酚和12.5 g碳酸氫鉀，加入75 mL乙酸乙酯和5 mL超純水，攪拌均勻，在冰水浴的條件下向上述混合溶液中滴加9 mL氯甲酸甲酯，持續(xù)攪拌1 h，再加入25 mL超純水，繼續(xù)攪拌3 h.反應(yīng)結(jié)束后分液，棄去水相，將有機(jī)相依次用超純水、1 mol/L的硫酸溶液、水與飽和氯化鈉溶液洗滌，用適量無水硫酸鎂干燥，過濾后將溶劑蒸干，將所得到的固體用苯重結(jié)晶得到間甲酯氨基苯酚(MAP).

稱取11.5 g間甲酯氨基苯酚與12.5 mL乙酰乙酸乙酯混合，將所得到的懸浮液分多次加至30 mL濃硫酸中控制溫度為60 ℃，加入完畢后，攪拌2 h，再向該溶液中加入150 mL冰水混合物，繼續(xù)攪拌至晶體析出，過濾分離，依次用超純水和乙醚洗滌濾餅，干燥后得到7-甲酯氨基-4-甲基香豆素(MAMC).

取14 g MAMC加入到30 mL 45%氫氧化鉀水溶液中，在85 ℃下攪拌20 min.待MAMC完全溶解后，加水稀釋至100 mL，再在冰水浴中攪拌，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至約5～6，再用氨水調(diào)節(jié)溶液pH至8左右，持續(xù)攪拌直至產(chǎn)物完全結(jié)晶析出.過濾，依次用水和乙醚洗滌濾餅，干燥后得到7-氨基-4-甲基香豆素(AMC).

1.4.2 7-(雙十二烷基胺)-4-甲基香豆素的合成

取3.99 g(22.8 mmol)AMC與16.65 mL(0.069 mol)溴代十二烷溶解于250 mL DMF中，再加入18.9 g(0.137 mol)碳酸鉀，80 ℃下攪拌12 h，反應(yīng)完畢后過濾，蒸發(fā)溶液除去DMF，向溶液中加入大量丙酮，冰水浴攪拌直至固體完全析出.過濾，得到7-(雙十二烷基胺)-4-甲基香豆素(DDAMC).

1.4.3 7-(雙十二烷基胺)-4-羥甲基香豆素

取1.0 g(1.96 mmol)DDAMC和0.44 g(3.93 mmol)二氧化硒分散于50 mL二甲苯中，劇烈攪拌回流24 h，反應(yīng)完畢后，過濾，減壓濃縮得到深褐色油狀物.用35 mL甲醇將所得油狀物溶解后，加入0.15 g(3.92 mmol)硼氫化鈉，攪拌4 h.反應(yīng)結(jié)束后，使用1 mol/L的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至中性.使用氯仿萃取3次，合并后用無水硫酸鎂進(jìn)行干燥，真空干燥得到7-(雙十二烷基胺)-4-羥甲基香豆素.

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡檢測

采用種子生長法制備的金納米棒和介空二氧化硅包覆的金納米棒的TEM圖見圖1.由圖1a可見，金納米棒內(nèi)核為桿狀，粒徑約為13 nm×50 nm，粒徑均一且分散性好；由圖1b可見，包覆了一層厚度為10～15 nm介孔二氧化硅的橢球形的金納米棒，外層二氧化硅殼具有介孔結(jié)構(gòu).

a)GNR的TEM圖；b)GNR@SiO2的TEM圖

2.2 Zeta電位的測定

對GNR(G),GNR@SiO2(GS),GNR@SiO2-COOH(GSC),GNR@SiO2-DOX(GSD),GNR@SiO2-DOX@CouC12(GSDC)，GNR@SiO2-DOX@CouC12-HA (GSDCH)的電位變化圖見圖3.由圖3可見，由于GNRs表面存在CTAB,GNR的電位為(+45±3.6)mV.由于Si-OH的離子化，包覆二氧化硅之后,GS的電位降至(-20.5±1.0)mV.隨著與羰基的成功結(jié)合，GSC的電位降至(-39.6±3.5)mV.載入DOX,GSD 的電位為(-14.8±3.0)mV,這是由鹽酸阿霉素所帶的正電荷引起的變化.由于存在大量的氨基，結(jié)合香豆素后，GSDC 的電位變成(+31±2.3)mV.引入 C16-HA后,GSDCH的電位又轉(zhuǎn)變成負(fù)電位(-10.1±5.1)mV.鑒于C16-HA 鏈帶負(fù)電荷,這個結(jié)果表明HA被成功包覆上.

1)GNR;2)GNR@SiO2;3)G3.GNR@SiO2-COOH; 4)GNR@SiO2-COOH+DOX;5)GNR@SiO2-DOX@CouC12; 6)GNR@SiO2-DOX@CouC12@HA

2.3 UV-vis-NIR檢測

GNRs,GNR@SiO2,GSC,GSD,GSDC 和 GSDCH 的紫外-可見光-近紅外吸收光譜圖見圖4.由圖4紫外-可見光-近紅外吸收光譜可見，GNR的縱向表面等離子體共振(LSPR)峰出現(xiàn)在785 nm處且橫向表面等離子體共振(TSPR)峰出現(xiàn)在514 nm處.當(dāng)二氧化硅層包覆在所合成的棒狀金納米粒子上后，其LSPR峰藍(lán)移至768 nm處，結(jié)果顯示金納米棒成功包覆了二氧化硅層.經(jīng)過層層組裝之后，LSPR峰最終紅移至 802 nm處，純的DOX的紫外吸收在480～500 nm.當(dāng)載入DOX 時，TSPR 峰劇烈增強(qiáng)并且在480～500 nm范圍處出現(xiàn)肩峰，結(jié)果顯示DOX被成功載入復(fù)合物中.

圖4 UV-vis-NIR吸收光譜

2.4 復(fù)合納米材料的光熱升溫曲線

金納米棒的光熱性能具有重要的意義，GNR和GNR@SiO2在不同功率的808 nm的近紅外激光照射下溫度的變化見圖5.

a)金納米棒; b)二氧化硅包埋的金納米棒

由圖5可見，在2 W的光照下，在300 s時GNR和GNR@SiO2的溫度分別上升了41.4 ℃和41.3 ℃.說明該材料具有優(yōu)異的光熱性能，癌細(xì)胞在42 ℃以上的高溫下會發(fā)生凋亡[12]，故金納米棒的光熱性能可用于腫瘤熱療.

2.5 納米載藥體系的生物相容性評價

理想的抗腫瘤藥物要滿足高效低毒，本文通過MTT法探討了游離的DOX對Hela細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞的毒性，結(jié)果見圖6.由圖6a可見：細(xì)胞與單獨(dú)DOX共孵育時，隨著DOX濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯降低，但仍高于50%，在Hela細(xì)胞中，光照增加了游離DOX的細(xì)胞毒性.

金納米棒和載入DOX的金納米棒對Hela細(xì)胞以及MCF-7細(xì)胞的毒性見圖6b.由圖6b可見，金納米棒的濃度增加至200 μg/mL時，Hela細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞的存活率均在80%以上，說明GNR對Hela細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞均無明顯毒性，具有較好的生物相容性.載入DOX之后，隨著GSCH濃度的增加，Hela細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞存活率均有所下降，但Hela細(xì)胞的存活率顯著下降，表明該納米材料對Hela細(xì)胞具有靶向性.

綜上可知：未加納米材料，游離的DOX對細(xì)胞無靶向性；而將DOX載入納米材料后，Hela細(xì)胞的存活率遠(yuǎn)低于MCF-7細(xì)胞，納米材料表現(xiàn)出明顯的靶向性.

a)游離DOX細(xì)胞毒性；b)GNR在Hela細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中的細(xì)胞毒性

3 結(jié)論

(1)本文研制了一種特殊的腫瘤靶向多功能納米載體，這種納米載體以金納米棒(GNR)為核，其表面包覆了一層介孔二氧化硅并在介孔中負(fù)載藥物，介孔二氧化硅表面通過酸醇縮合修飾一層近紅外(NIR)激光敏感的香豆素衍生物，香豆素親油膜將藥物包封在介孔內(nèi)的同時亦是智能的控制開關(guān).

(2)DOX被巧妙地載入內(nèi)部介孔二氧化硅中并用香豆素層封堵，除了作為長期穩(wěn)定劑外，外部的透明質(zhì)酸也可使這種載藥納米載體選擇性地靶向于Hela細(xì)胞或CD44受體過度表達(dá)的腫瘤區(qū)域.

(3)該納米技術(shù)結(jié)合了光熱性質(zhì)和藥物傳遞性質(zhì)，具有可控性和靶向釋藥特性，表現(xiàn)出優(yōu)越的生物相容性和抗癌功效.這種靶向納米載體為臨床應(yīng)用光熱協(xié)同療法提供了具有潛力的藥物傳遞系統(tǒng).