馮蘇敏，賀添艷，李曉

（河南省誠建檢驗檢測技術(shù)股份有限公司，河南鄭州 450000）

0 引言

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特氏菌，廣泛存在于自然界中，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一[1-5]。單增李斯特氏菌食物中毒是由該菌產(chǎn)生的溶血素溶劑引起，易感者常為新生兒、孕婦及40歲以上人群，臨床表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、抽搐、發(fā)熱、昏迷、流產(chǎn)、敗血癥直至死亡[6-11]。2011年，美國由該菌造成16人死亡，是自1998年以來致死人數(shù)最多的一次食源性疾病疫情。因此，單增李斯特氏菌檢驗是食品衛(wèi)生微生物檢驗重點之一。

目前，能力驗證已經(jīng)成為了各檢測機構(gòu)補充其內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)，為自身的持續(xù)改進和質(zhì)量管理提供信息的主要手段，并且近幾年政府部門、社會組織及其他方在選擇提供技術(shù)服務檢驗檢測機構(gòu)時，將能力驗證的結(jié)果作為重要依據(jù)。重慶市食品藥品檢驗檢測研究院以GB 4789.30—2010為檢驗依據(jù)，對樣品編號TF0580094的3個樣品進行單增李斯特氏菌定性檢測并取得滿意結(jié)果[12]。四川省食品藥品檢驗檢測院依據(jù)《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》進行檢測，利用BAX system Q7型全自動病原微生物檢測系統(tǒng)對能力驗證中的3個樣品進行快速篩查，取得滿意結(jié)果[13]。為提高實驗室微生物檢測能力，實驗室參加中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測能力驗證計劃（ACAS-PT541(2018)），按照國標方法及相關(guān)儀器對樣品進行檢測，試驗對此次能力驗證過程及結(jié)果進行分析，總結(jié)經(jīng)驗教訓為日常的檢驗工作提供技術(shù)性支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2瓶白色凍干塊狀的乳品樣品，于2～6℃下保存，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供，代碼分別為18-Y493，18-X650。

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSAYE）、李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）、PALCAM培養(yǎng)基、李斯特氏菌顯色平板、革蘭氏染色液試劑盒、單增李斯特氏菌生化鑒定套裝，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

BSC-1300IIA2型生物安全柜、SW-CJ-2FD型超凈工作臺、BPX-272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BXM-75VE型立式壓力滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 標準菌株

（1） 陽性對照菌株。單核細胞增生李斯特氏菌，菌株編號：BNCC314197（ATCC19115等效菌株），購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

（2）陰性對照菌株。英諾克李斯特氏菌，菌株編號：BNCC186087（ATCC33090等效菌株），購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

以上菌株傳代次數(shù)均未超過5代。

1.3 試驗方法[14-15]

1.3.1 樣品處理

樣品需要用40.0 mL無菌再水化。無菌開啟樣品后，立即加入4 mL無菌水進行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再反復用余下的無菌水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即為待測樣品原液。

1.3.2 增菌

以無菌操作吸取取25 mL樣品原液轉(zhuǎn)至含有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2 min，于30±1℃下培養(yǎng)24±2 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于30±1℃下培養(yǎng)24±2 h。

單增李斯特氏菌常見的增菌方法有LB二次增菌法，EB法、改良FDA法及Fraser肉湯增菌法，通過4種方法對同一樣品進行增菌，采用PALCAM選擇性平板進行分離，再進行國標生化鑒定，對比4種增菌方法對樣品的檢出率，LB二次增菌法是4種方法中檢出率較高且較為穩(wěn)定的增菌方法，因此選擇LB二次增菌法。

1.3.3 分離

取LB2增菌液一環(huán)劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于36±1℃下培養(yǎng)24～48 h，觀察各個平板上菌落生長情況。李斯特氏菌顯色平板中所含色素與單增李斯特氏菌具有的酶發(fā)生特異性反應，水解底物，釋放出顯色基團，在平板上，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)藍綠色的光滑規(guī)則的小菌落，抑制劑和配套試劑可抑制雜菌的生長。另外李斯特氏菌常見分離平板還有PALCAM，OXA，OXA和LPM，對4種選擇性分離培養(yǎng)基上目標菌的生長率和非目標菌的抑制性進行比較，結(jié)果顯示目標菌在LMP上的生長率最低，其余3種分離培養(yǎng)基的生長率差異不大；綜合比較對非目標菌的抑制性，PALCAM最佳；然而檢測雜菌較多的樣品時，PALCAM的選擇性靈敏度最高[16]。

1.3.4 初篩

自選擇性平板上分別挑取5個典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36±1℃下培養(yǎng)24±2 h，同時在TSA-YE平板上劃線，于36±1℃下培養(yǎng)18～24 h，選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進行鑒定。

1.3.5 鑒定

根據(jù)初篩結(jié)果，對1.3.4的純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢、動力試驗、溶血試驗過氧化氫酶試驗及生化鑒定，生化鑒定按生化試劑盒操作說明進行。

單增李斯特氏菌微量生化試驗見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

樣品18-X650在PALCAM瓊脂平板為黃白色菌落，在李斯特氏顯色平板為黃白色菌落。樣品18-X650在PALCAM平板和李斯特氏顯色平板上均無典型或可疑菌落。樣品18-Y493在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈；在李斯特氏顯色平板上為藍綠色菌落，周圍有不同透明暈圈。初步可判斷樣品18-X650為非單核細胞增生李斯特氏菌，樣品18-Y493為可疑單核細胞增生李斯特氏菌。

2.2 鑒定結(jié)果

對樣品18-Y493的純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢、動力試驗、溶血試驗及生化鑒定。結(jié)果顯示，樣品18-Y493為革蘭氏陽性短桿菌，在半固體上呈傘狀生長，在血平板上為寬大、輪廓清晰、完全透明的溶血圈；陽性菌株為革蘭氏陽性短桿菌，在半固體上呈傘狀生長，在血平板上為狹窄、清晰、明亮的溶血圈。

生化試驗反應結(jié)果見表2。

表2 生化試驗反應結(jié)果

通過與陽性菌株的系列反應結(jié)果相比較，可判斷樣品18-Y493為非單核細胞增生李斯特氏菌。

此次結(jié)果報告為樣品18-X650未檢出單核細胞增生李斯特氏菌25 mL，樣品18-Y493未檢出單核細胞增生李斯特氏菌25 mL。中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心判定實驗室檢測結(jié)果與指定值一致，結(jié)果評價為滿意。

3 結(jié)論

食品微生物檢測中，檢測雜菌較多的樣品時，常使用2種及2種以上分離平板對目標菌進行分離篩選，以防漏檢。國標GB 4789.30—2016中單增李斯特氏菌選用李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板，李斯特氏顯色平板的選擇特異性較強，由于防止其對其他菌進行抑制的同時干擾到目標菌，使目標菌生長緩慢或抑制其生長，而PALCAM平板可以擴大目標菌的檢測范圍，因此需要2種平板配合使用，提高目標菌的檢出率。單增李氏特菌檢驗中在TSA-YE平板上純化是必須的，因為在PALCAM和李斯特氏菌顯色平板上分離菌落時可能黏有不可見的受抑微生物。挑取5個典型菌落的原因是1個樣品中可能分離到1種以上的李斯特氏菌。

此外，依據(jù)樣品18-Y493的生化鑒定反應結(jié)果，可判斷樣品18-Y493為非單核細胞增生李斯特氏菌，疑似斯氏李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌，由于實驗室條件限制，未能判定其菌株類型。此次實驗室按照CNAS RL02：2011《能力驗證規(guī)則》等CNAS政策要求參加微生物項能力驗證，并取得滿意結(jié)果。此次結(jié)果可作為證明實驗室技術(shù)能力的有效證明，為監(jiān)管部門、客戶和其他利益相關(guān)方選擇、評價、認可實驗室提供參考依據(jù)。參加能力驗證是實驗室質(zhì)量控制的重要手段，為不斷提升自身檢驗檢測能力，發(fā)現(xiàn)和解決檢測過程中所遇到的問題，實驗室將持續(xù)性參加能力驗證項目。