鐘 鈺，鄭 琴*，胡鵬翼，黃小英，楊 明*，任桂林，張科楠，李 菁

1江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室，南昌 330004；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000

失眠是睡眠中斷或睡眠時間減少所引起的一種睡眠障礙，主要表現(xiàn)為睡眠時間和睡眠深度的不足。據(jù)專家估計，到2020年全球大約有7億多失眠者。大量的失眠癥患者伴有不同程度抑郁、焦慮癥狀，導(dǎo)致患者精神活動效率下降，造成病人免疫功能下降、植物神經(jīng)功能紊亂，增加糖尿病、冠心病、老年癡呆癥等的患病風險[1]。治療失眠比較常見的藥物主要包含苯二氮卓類、非苯二氮卓類、具有鎮(zhèn)靜作用的抗抑郁藥等幾種類型[2]，長時間使用易產(chǎn)生依賴性、耐受性、戒斷癥狀、反跳作用等各種不良反應(yīng)。長期以來人們寄希望于通過天然植物來達到更安全、不良反應(yīng)更小的治療目的，越來越多的學(xué)者熱衷于探求新的、安全的輔助或替代療法以治療失眠。研究發(fā)現(xiàn)，芳香植物精油通過吸嗅療法具有良好的鎮(zhèn)靜催眠作用，相比口服藥物安全性強，可避免日間宿醉、首過消除和對胃腸道刺激。沉香精油[3]、川芎精油[4]、佩蘭精油[5]吸入給藥均具有鎮(zhèn)靜催眠作用，可顯著減少動物自主活動，縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間。在復(fù)方精油的相關(guān)研究方面，一種用甜牛至精油、德國甘菊精油和薰衣草精油調(diào)配而成的復(fù)方精油[6]和以左旋芳樟醇為主要原料配制的復(fù)方精油[7]均具有安眠功效。

本實驗基于芳香療法理論為指導(dǎo)，研究一種以薰衣草精油、甜橙精油、檀香精油等多種具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁的芳香植物精油配伍的復(fù)方安神精油吸入給藥的鎮(zhèn)靜催眠作用，采用GC-MS分析復(fù)方安神精油揮發(fā)性化學(xué)成分以及入腦的主要化學(xué)成分，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討復(fù)方安神精油治療失眠癥的作用機制，旨在為復(fù)方安神精油通過芳香療法治療與改善失眠癥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物

6～8周齡ICR小鼠，雌雄各半，體重25～35 g，江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008。

1.2 主要藥品與試劑

復(fù)方安神精油，江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室提供，批號20180715，主要成分為薰衣草精油、甜橙精油、檀香精油等；地西泮片(北京益民藥業(yè)有限公司，批號H11020898)；戊巴比妥鈉(德國Merck公司，批號20171230)；生理鹽水注射液(江西科倫藥業(yè)有限公司，批號C18081701)；吐溫-80(上海三浦試劑公司，批號：20180323)；乙醇消毒液(南昌利康藥械實業(yè)有限公司，批號18041601)；氫氧化鈉(西隴化工股份有限公司，批號20180227)；三氯甲烷(西隴科學(xué)股份有限公司，批號20170705)；乙醚(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20180601)。

1.3 主要設(shè)備及儀器

超聲霧化香薰機(深圳市康美太實業(yè)有限公司)；動物香薰室(有機玻璃制成的50×50×40 cm大箱結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部放置4個20×20×20 cm可通氣體的小箱結(jié)構(gòu)，中間可放置超聲霧化香薰機)；SMART行為記錄視頻分析系統(tǒng)(Panlab公司)；Agilent 7890A氣相色譜-5975質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)軟件與數(shù)據(jù)庫

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)、TTD 數(shù)據(jù)庫(https://db.idrblab.org/ttd/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https:// www.drugbank.ca/)、Cytoscape 7.0 軟件。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

選用ICR小鼠，雌雄各半。實驗期間，動物可得到足夠的食物和水。實驗間飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為21±1 ℃，濕度55%±5%，明暗交替12 h，自由飲水和進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。實驗設(shè)空白組(正常喂養(yǎng))，3個復(fù)方安神精油組(吸入給藥1天組、吸入給藥7天組及吸入給藥14天組)，3個陽性藥組(陽性藥給藥1天組，陽性藥給藥7天組及陽性藥給藥14天組)。復(fù)方安神精油各組小鼠每天吸入濃度為2×10-3的復(fù)方安神精油(預(yù)實驗測得的有效吸嗅濃度，復(fù)方安神精油用濃度為1%的吐溫-80溶液稀釋)，將超聲霧化香薰機置于動物香薰室中，使藥物充分揮發(fā)彌漫整個香薰室內(nèi)，再將復(fù)方安神精油各組小鼠依次置入香薰室中，蓋上箱蓋，連續(xù)吸入給藥60 min，吸嗅時間段為每日8:00～16:00。地西泮用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的溶液，陽性藥各組灌胃地西泮溶液，給藥劑量為1 mg/kg(根據(jù)成人臨床劑量采用體表面積等效劑量比值換算成小鼠等效劑量)，空白組和復(fù)方安神精油各組灌胃等體積的蒸餾水。

2.2 小鼠自主活動測試

各組小鼠于末次給藥30 min后，對每組小鼠分別進行自主活動測試。小鼠適應(yīng)環(huán)境5 min，計數(shù)3 min內(nèi)小鼠移動的距離和站立次數(shù)等行為學(xué)參數(shù)，比較各組小鼠間的差異。自主活動測試指標：移動距離，單位：cm；最大速度，單位：cm/s；平均速度，單位：cm/s；靜止時間，單位：s；站立次數(shù)。

2.3 戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期與睡眠時間

自主活動測試完畢后，各組小鼠分別腹腔注射閾劑量45 mg/kg(預(yù)實驗測得引起100%小鼠睡眠的最小劑量)的戊巴比妥鈉，于給藥前用生理鹽水配制戊巴比妥鈉溶液。以給藥后小鼠翻正反射消失達1 min為入睡指標，注射藥物至翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期，翻正反射消失至恢復(fù)所經(jīng)歷的時間為睡眠時間，記錄小鼠睡眠潛伏期與睡眠時間。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2.5 復(fù)方安神精油的化學(xué)成分與入腦的化學(xué)成分分析

2.5.1 腦組織樣品的制備

選取10只SD大鼠，雌雄各半。大鼠每天鼻腔給藥20 μL的復(fù)方安神精油，連續(xù)鼻腔給藥7天，于第7天鼻腔給藥完畢30 min后處死，取出全腦，生理鹽水洗凈，再加入生理鹽水2 mL勻漿，離心，取上清液1 mL，加入2 mol/L NaOH 50 μL，三氯甲烷2 mL振搖，離心，取出三氯甲烷層，10只合并，揮干，加入乙醚2 mL，微孔濾膜過濾，即得[8]。

2.5.2 GC-MS色譜條件

氣相色譜條件：采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛細管色譜柱，載氣為高純He(99.999%)，進樣量為l μL，分流比40∶1，流速1 mL/min。升溫程序：初始溫度40 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升溫至220 ℃，再以25 ℃/min 升溫至280 ℃(保持9 min)。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃，溶劑延遲3.0 min，質(zhì)量掃描模式全掃描，掃描范圍30～650 amu。標準譜庫 NIST11檢索，峰面積歸一法計算各組分相對百分含量。

2.6 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建對復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、Pubchem數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出治療失眠癥的活性成分，將治療失眠癥的活性成分與復(fù)方安神精油主要化學(xué)成分取交集，得到復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)活性成分。利用TTD數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)篩選出治療失眠癥靶點以及復(fù)方安神精油活性成分靶點，將治療失眠癥靶點與復(fù)方安神精油活性成分靶點取交集,得到復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)作用靶點。將復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)活性成分和治療失眠癥相關(guān)作用靶點導(dǎo)入Cytoscape7.0軟件,構(gòu)建復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò),預(yù)測和篩選出復(fù)方安神精油治療失眠癥關(guān)鍵性的作用靶點與活性成分。

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠自主活動測試實驗結(jié)果

小鼠自主活動測試實驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，與空白組比較，吸入給藥1天組顯示出鎮(zhèn)靜催眠作用，吸入給藥7天和吸入給藥14天組的鎮(zhèn)靜催眠作用極顯著，小鼠的自主活動量極顯著減少，表現(xiàn)為移動距離和站立次數(shù)極顯著減少(P<0.01)、平均速度與最大速度極顯著減小(P<0.01)、靜止時間極顯著增加(P<0.01)，陽性藥給藥1天組的鎮(zhèn)靜催眠作用極顯著(P<0.01)，隨著給藥時間的的延長，陽性藥給藥7天、陽性藥給藥14天組的小鼠自主活動量增加。

3.2 戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期與睡眠時間的實驗結(jié)果

戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期與睡眠時間實驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在睡眠潛伏期方面，與空白組相比，陽性藥給藥1天組的睡眠潛伏期極顯著減少(P<0.01)，其次是吸入給藥7天(P<0.01)、吸入給藥14天組(P<0.01)，隨著給藥時間的延長，陽性藥給藥14天組的睡眠潛伏期有增加的的趨勢；在睡眠時間方面，與空白組相比，陽性藥給藥1天組的睡眠時間極顯著增加(P<0.01)，其次是吸入給藥7天組(P<0.01)、吸入給藥14天組(P<0.01)，隨著給藥時間的延長，陽性藥給藥14天組的睡眠時間有減少的趨勢。

表1 復(fù)方安神精油對小鼠移動距離、平均速度、最大速度、靜止時間、站立次數(shù)的影響

注：其他各組與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 復(fù)方安神精油對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間的影響

注：其他各組與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.3 復(fù)方安神精油的化學(xué)成分與入腦化學(xué)成分分析結(jié)果

復(fù)方安神精油的主要化學(xué)成分見表3，GC-MS分析復(fù)方安神精油成分TIC圖見圖1。鑒定出30個復(fù)方安神精油的化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的93.39%。復(fù)方安神精油主要成分為酯類、醇類、烯烴類、烷烴類等化合物，其中含量最高的是D-檸檬烯(24.07%)，其次是芳樟醇(21.98%)、乙酸芳樟酯(15.37%)，α-蒎烯(5.39%)，α-檀香醇(4.8%)等。復(fù)方安神精油入腦主要化學(xué)成分見表4，GC-MS分析復(fù)方安神精油入腦成分TIC圖見圖2。通過計算機自動檢索標準譜庫 NIST11，并與復(fù)方安神精油成分TIC圖以及復(fù)方安神精油的主要化學(xué)成分進行比較，分析與鑒定出6個復(fù)方安神精油入腦的化學(xué)成分，分別是D-檸檬烯(D-Limonene),芳樟醇(Linalool),乙酸芳樟酯(Linalyl acetate),α-檀香醇(α-Santalol)，十九烷(Nonadecane)、二十烷(Eicosane)。

3.4 復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析

基于復(fù)方安神精油化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果，由數(shù)據(jù)庫篩選得到復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)作用靶點見表5，復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)活性成分見表6，構(gòu)建復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，圖中共有64個節(jié)點，每條邊代表活性成分與靶點間的相互作用。其中紅色節(jié)點代表復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)的39個作用靶點，形狀越大代表其關(guān)聯(lián)的活性成分越多；綠色節(jié)點代表復(fù)方安神精油中25個治療失眠癥相關(guān)的活性成分；形狀越大代表其關(guān)聯(lián)的作用靶點越多。具有很高的Degree的節(jié)點為“中樞節(jié)點”，在整個復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位[9]。因此在復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖中預(yù)測NR1I2(孕烷X受體)、ESR1(雌激素受體)、NR1I3(組成性雄甾烷受體)、GABRA1(γ-氨基丁酸受體α1)、CYP19A1(細胞色素P450)、NR1H4(膽汁酸受體)靶蛋白與復(fù)方安神精油發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用密切相關(guān)。此外，預(yù)測和篩選Dibutyl phthalate、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpineol、Terpinen-4-ol在復(fù)方安神精油治療失眠癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

圖1 GC-MS分析復(fù)方安神精油成分TIC圖Fig.1 GC-MS analysis of composite compound anshen essential oil TIC diagram

圖2 GC-MS分析復(fù)方安神精油入腦成分TIC圖Fig.2 GC-MS analysis of compound anshen essential oil into brain component TIC diagram

表3 復(fù)方安神精油主要化學(xué)成分

表4 復(fù)方安神精油入腦化學(xué)成分

圖3 復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Component-target network of compound anshen essential oil

4 結(jié)論

芳香吸入療法中精油的芳香物質(zhì)經(jīng)鼻腔吸入后作用于嗅腦，促進神經(jīng)物質(zhì)的釋放進而調(diào)控植物神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)動體內(nèi)積極因素并釋放各種情感信息，從而達到治療、防治疾病的目的[10]。由于鼻腔與腦組織之間存在著直接的解剖學(xué)通道，藥物可通過鼻粘膜吸收，繞過血腦屏障直接轉(zhuǎn)運入嗅球或腦脊液進而直接進入腦組織[11]?！拔崛肽X”是一種無損性給藥方式，最大限度地減少毒副作用，因此可能成為有效控制和治療失眠等精神類疾病的給藥途徑。動物自主活動測試實驗和閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期與睡眠實驗是治療失眠癥藥物藥效的常見評價方法。研究結(jié)果表明，復(fù)方安神精油具有鎮(zhèn)靜催眠作用，可顯著減少動物自主活動，縮短睡眠潛伏期、延長睡眠時間，隨著吸入給藥時間的增加未表現(xiàn)出顯著的藥物耐受性。

表5 復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)作用靶點

表6 復(fù)方安神精油治療失眠癥相關(guān)活性成分

通過GC-MS追蹤復(fù)方安神精油的揮發(fā)性化學(xué)成分，其中D-檸檬烯[12]、芳樟醇[13]、乙酸芳樟酯[14]、α-檀香醇[15]均已有報道證明具有中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜作用；此外，D-檸檬烯具有抗焦慮、舒緩情緒的作用[16]，芳樟醇具有緩解抑郁樣作用[17]，α-蒎烯具有抑制焦慮情緒[18]、緩解壓力[19]等作用，推測復(fù)方安神精油的鎮(zhèn)靜催眠功效與其主要化學(xué)成分及活性相關(guān)。GC-MS分析復(fù)方安神精油入腦主要化學(xué)成分為D-檸檬烯,芳樟醇,乙酸芳樟酯,α-檀香醇，十九烷，二十烷。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建的復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，在GC-MS追蹤的30個復(fù)方安神精油的揮發(fā)性化學(xué)成分中，篩選出25個治療失眠癥相關(guān)活性成分作用于39個治療失眠癥相關(guān)作用靶點，其中作用靶點包括5-羥色胺受體、γ-氨基丁酸受體、腎上腺素受體、去甲腎上腺素受體、多巴胺受體、乙酰膽堿受體、食欲素受體以及膽汁酸受體等。因此復(fù)方安神精油治療失眠癥是通過多個成分作用于多個靶點產(chǎn)生效應(yīng)，體現(xiàn)了復(fù)方安神精油多成分、多靶點的作用特點。預(yù)測復(fù)方安神精油主要通過NR1I2、ESR1、NR1I3、GABRA1、CYP19A1、NR1H4相關(guān)靶蛋白發(fā)揮藥效作用，篩選出Dibutyl phthalate、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpineol、Terpinen-4-ol在復(fù)方安神精油治療失眠癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。GC-MS追蹤的30個復(fù)方安神精油的主要揮發(fā)性化學(xué)成分中含量最高的化學(xué)成分以及入腦的主要化學(xué)成分D-limonene、linalool、linalyl acetate、α-pinene、α-santalol、nonadecane具有治療失眠癥相關(guān)性并在復(fù)方安神精油活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖同樣占據(jù)重要的地位。對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的關(guān)鍵靶點進行相關(guān)研究文獻驗證，孕烷X受體作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與多種藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的誘導(dǎo)表達，在機體異源性和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝及排泄過程中起重要的調(diào)控作用，參與機體脂質(zhì)、膽固醇和糖代謝從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[20]。雌激素受體存在于腦的許多部位，廣泛表達于與情感刺激加工有關(guān)的腦區(qū)域，如海馬、杏仁核、下丘腦、額皮質(zhì)和脊核，能影響人類各種認知、情感及行為，調(diào)節(jié)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和單胺氧化酶，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)控作用[21]。組成性雄甾烷受體經(jīng)配體激活后可調(diào)控藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運體的表達和活性，調(diào)節(jié)毒性物質(zhì)的清除、解毒及代謝過程，保護機體免受外源性化學(xué)物質(zhì)和內(nèi)源性毒性脂質(zhì)損傷，并參與糖、脂代謝和炎癥等信號通路的調(diào)控[22]。γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸(GABA)與失眠機制的發(fā)生及進展聯(lián)系密切，其主要作用的受體為γ-氨基丁酸α型受體[23]。細胞色素P450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，參與生物體內(nèi)的甾醇類激素合成等過程[24]，參與藥物代謝并對細胞因子和體溫調(diào)節(jié)具有重要作用。膽汁酸受體作為一種膽汁酸激活的核受體，參與機體多種生理活動的調(diào)節(jié)，包括膽汁酸代謝、脂代謝、糖代謝、肝臟保護等過程[25]，與抗膽堿能、鎮(zhèn)靜催眠等作用密切相關(guān)?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測和篩選的復(fù)方安神精油活性成分均具有一定的鎮(zhèn)靜催眠作用相關(guān)性，其活性成分與作用靶點之間的關(guān)聯(lián)性，在一定程度上證實復(fù)方安神精油鎮(zhèn)靜催眠作用研究以及復(fù)方安神精油主要化學(xué)成分與入腦的主要化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果的可靠性。

研究表明，復(fù)方安神精油具有鎮(zhèn)靜催眠功效；復(fù)方安神精油的主要化學(xué)成分與入腦的主要化學(xué)成分中含有多種具有神經(jīng)中樞鎮(zhèn)靜催眠作用以及抗焦慮、抗抑郁作用的揮發(fā)性化學(xué)成分；基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測和篩選出25個治療失眠癥相關(guān)活性成分作用于39個治療失眠癥相關(guān)作用靶點，體現(xiàn)復(fù)方安神精油多成分、多靶點的鎮(zhèn)靜催眠作用特點，上述結(jié)果與文獻報道基本一致。本研究為基于芳香療法理論指導(dǎo)下的復(fù)方安神精油發(fā)揮其鎮(zhèn)靜催眠功效與進一步深入闡明復(fù)方安神精油治療失眠癥的作用機制提供科學(xué)依據(jù)，并為探索治療失眠癥安全的輔助與替代療法提供新途徑。