周連玉，鐘 松，朵紅梅，喬 楓

1青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2青海省第四人民醫(yī)院，西寧810008

禾草內(nèi)生真菌是指在禾草類植株內(nèi)生長并完成全部或大部分生活周期，而不顯示外部癥狀的一類真菌[1]，許多研究表明了禾草內(nèi)生真菌能產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì)，如抗菌活性類[2]、除草活性類[3]等。因此，內(nèi)生真菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑。

許多研究者從不同植物體中分離出多種內(nèi)生真菌，以內(nèi)生真菌、內(nèi)生真菌培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)物的提取物進行抑菌活性研究[4,5]，從真菌菌絲生長[4]、菌絲形態(tài)[6]、孢子萌發(fā)[7]以及細菌生長[8]和細菌細胞結(jié)構(gòu)[9]等方面證實了內(nèi)生真菌的生物防治效果。揮發(fā)性物質(zhì)主要包括揮發(fā)性生物堿、烴類、脂類、醇類、酸類、酯類、酮類、酚類和萜類物質(zhì)。內(nèi)生真菌代謝的揮發(fā)性成分發(fā)揮著溶栓活性[10]、抑菌活性[11]等多種功能。

中華羊茅(Festucasinensis)是一種內(nèi)生真菌侵染率高的多年生草本植物，具有適口性好、營養(yǎng)價值高、抗寒、抗旱、發(fā)病率低等優(yōu)勢[12]。已有研究報道了中華羊茅內(nèi)生真菌菌株的生物學(xué)與生理學(xué)特性、生物活性、形態(tài)多樣性及分類學(xué)地位[13-17]。前期的研究工作發(fā)現(xiàn)采用平板對峙培養(yǎng)中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo?菌株對一些病原菌有抑制作用，在離體葉片上其代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物能控制植物病原菌的感病率和病情發(fā)展，并測定了乙酸乙酯粗提物的各組分含量，其中主要成分是一些揮發(fā)性物質(zhì)[15]。本研究以中華羊茅Epichlo?菌株為材料，先測定其揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯粗提物、水相部分和發(fā)酵液對真菌菌絲體生長速率的作用；再進一步探討其不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)和芽管生長以及細菌生長的影響，并通過GC-MS技術(shù)分析其揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分；為開發(fā)利用新型熏蒸生物農(nóng)藥提供一定依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.菌株[15]、小麥根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)和新月彎孢(Curvularialunata)由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護所提供，黑曲霉(Aspergillusniger)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)購于廣東微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：純化和活化菌株采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL)；液體種子培養(yǎng)基采用PDB(馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL)；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為山梨醇100.0 g，酵母膏 3.0 g，葡萄糖 40.0 g，色氨酸 0.8 g，谷氨酸 10.0 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH5.6；真菌孢子萌發(fā)采用水瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂15 g，蒸餾水 1 000 mL)。

細菌培養(yǎng)基：細菌固體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4)；細菌液體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.4)。

1.2 方法

1.2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.培養(yǎng)

將3塊4 mm直徑的菌塊接種于種子培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，于25±1 ℃，130 rpm振蕩培養(yǎng)15天，所獲培養(yǎng)液作為液體菌種。將3 mL液體菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，25±1 ℃條件下130 rpm振蕩培養(yǎng)55 天。

1.2.2 粗提物的提取

每次取300 mL研磨的發(fā)酵產(chǎn)物在揮發(fā)油提取器中100 ℃條件下持續(xù)4 h蒸餾得到的揮發(fā)性物質(zhì)，然后用乙酸乙酯萃取發(fā)酵產(chǎn)物，分別得到乙酸乙酯部分及水相部分，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 ℃減壓濃縮至干，得到浸膏用于抑菌活性測定。

1.2.3 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對菌絲生長的影響

采用瓊脂擴散法測定揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯部分、水相部分、發(fā)酵液稀釋液對小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉4種真菌生長的影響。首先用約2 mL二甲基亞砜將粗提物(乙酸乙酯粗提物或水相部分)0.15 g溶解，通過0.45 μm無菌濾膜定容至2 mL， 取400 μL至另一離心管，加1 200 μL二甲基亞砜，剩下1 600 μL，分別加至118.4 mL 50 ℃的無菌PDA培養(yǎng)基迅速混勻，再倒入12個9 cm平板中，即得粗提物濃度為250和1 000 μg/mL的培養(yǎng)基；對照為1 600 μL二甲基亞砜。揮發(fā)性物質(zhì)或發(fā)酵液原液1.5 mL用二甲基亞砜溶解，步驟同上，分別得到2.5、10 μL/mL。

將直徑4 mm真菌菌塊接種于培養(yǎng)皿中央，25±1 ℃培養(yǎng)，第4天測定菌落直徑。每個處理重復(fù)三次。計算公式如下：

菌絲生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處

理菌落直徑)/(對照菌落直徑-接種時菌塊直徑)]

×100%

1.2.4 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)和芽管長度的抑制效果

真菌接種于PDA，25±1 ℃培養(yǎng)7天后，將每個供試病原菌的培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL無菌水，用解剖針輕輕攪拌以洗脫孢子，用兩層無菌紗布過濾，血球計數(shù)板檢測孢子濃度，制備106cfu/mL孢子懸浮液。

采用懸滴法研究對真菌孢子萌發(fā)抑制作用，用無菌水稀釋揮發(fā)性物質(zhì)，得到不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)(1.25、2.5、5、10、20、40 μL/mL)，不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)與孢子懸浮液等量混合，混勻后吸取20 μL混合液滴加到水瓊脂上(水瓊脂事先滴在玻片上)，對照用孢子懸浮液與等量無菌水混合。每個處理重復(fù)三次。待干后放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中將玻片倒置，于25 ℃保濕培養(yǎng)8 h，觀察并計錄視野中總孢子數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)，芽管長度用帶有測微尺的顯微鏡校正后測量。

孢子萌發(fā)抑制率(%)=[(對照孢子萌發(fā)率-

處理孢子萌發(fā)率)/對照孢子萌發(fā)率]×100%

芽管長度抑制率(%)=[(對照芽管長度-

處理芽管長度)/對照芽管長度]× 100%

1.2.5 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對細菌的抑制效果

分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，采用血球計數(shù)板檢測細菌濃度，制備106cfu/mL細菌懸浮液。

采用濾紙片擴散法(濾紙片直徑15 mm)測定不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)1.25、2.5、5、10、20、40 μL/mL對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌作用。在無菌培養(yǎng)皿中倒入適量牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，鋪平凝固作為底層；將供試菌懸液與冷卻至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基以1∶9混合均勻，傾注到冷卻牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面的培養(yǎng)皿中。將無菌的濾紙片放入平板中央，以無菌水作為陰性對照，吸取不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)20 μL滴在滅菌的濾紙片，將處理好的平板置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察濾紙片周圍抑菌圈的大小，并測量其直徑。每個處理重復(fù)三次。

1.2.6 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)成分測定

利用頂空固相微萃取對揮發(fā)性物質(zhì)進行萃取，用Agilent 7890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-Wax毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA)分析鑒定其各成分。將一定量的揮發(fā)性物質(zhì)置于固相微萃取儀采樣瓶中，于60 ℃萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入240 ℃ GC-MS進樣口解吸4 min。

柱溫40 ℃保留2 min，以5 ℃/min 升溫至240 ℃，保持5 min；前進樣口溫度240 ℃；傳輸線溫度240 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)；載氣流量1.0 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣。質(zhì)譜條件：離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量范圍33～500 amu。

對總離子流圖的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫，確定各組揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法計算各個組分的相對含量。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標準差表示，各項指標釆用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(LSD，P<0.05)。采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件的線性回歸方程計算真菌孢子萌發(fā)IC50半致死濃度和IC90極限濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對四種真菌菌絲生長的影響

采用瓊脂擴散法測定揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯部分、水相部分、發(fā)酵液稀釋液對小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉4種真菌菌絲生長的影響。從表1可見，4種粗提物對總狀毛霉無抑制作用，對其他三種真菌均起到一定的抑制效果，且10 μL/mL濃度的揮發(fā)性物質(zhì)抑制效果顯著高于其他成分，其次是濃度為1 000 μg/mL的乙酸乙酯提取部分。由此可見，中華羊茅內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性主要存在揮發(fā)性物質(zhì)和乙酸乙酯部分，且揮發(fā)性物質(zhì)效果優(yōu)于乙酸乙酯部分。

表1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對4種真菌菌絲生長的作用

注：數(shù)值為平均值±標準差，小寫字母表示在0.05水平上不同提取物對同一真菌抑制率差異顯著性(P<0.05)。

Note:Values are means ± standard deviation (SD).Different lower case letters indicate a significant effect of different concentrations of crude extracts on radial growth of the tested fungus (P<0.05).

2.2 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)和芽管長度的抑制效果

2.2.1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)的抑制效果

采用懸滴法顯微觀察不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)1.25、2.5、5、10、20、40 μL/mL對小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉4種真菌孢子萌發(fā)率和芽管長度的作用。不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)均對4種真菌孢子萌發(fā)有一定的抑制作用(表2)，隨著濃度增加抑制孢子萌發(fā)率的效果增強，對同一真菌孢子萌發(fā)抑制率各濃度之間存在顯著性差異(P<0.05)，40 μL/mL揮發(fā)性物質(zhì)抑制效果顯著高于其他各濃度(P<0.05)。揮發(fā)性物質(zhì)濃度1.25～2.5 μL/mL對四種真菌孢子萌發(fā)抑制率大小依次為總狀毛霉>新月彎孢>小麥根腐離蠕孢>黑曲霉，濃度在5～40 μL/mL范圍內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)抑制真菌孢子萌發(fā)率為總狀毛霉>小麥根腐離蠕孢>新月彎孢>黑曲霉。由真菌孢子萌發(fā)抑制率線性回歸方程計算IC50半致死濃度和IC90極限濃度(表2)，對4種真菌孢子半致死濃度依次為總狀毛霉<小麥根腐離蠕孢<新月彎孢<黑曲霉。不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)在一定程度上均有抑制作用，就不同真菌而言，半致死濃度有差異，這就表明了針對不同真菌引起的病害應(yīng)選擇合適的揮發(fā)性物質(zhì)劑量。

表2 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對真菌孢子萌發(fā)率的抑制作用與孢子萌發(fā)抑制率IC50 和IC90值

續(xù)表2(Continued Tab.2)

揮發(fā)性物質(zhì)濃度Volatile substance (μL/mL) 小麥根腐離蠕孢B.sorokiniana新月彎孢C.lunata黑曲霉A.niger總狀毛霉M.racemosus孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)孢子萌發(fā)Spore germination rate (%)孢子萌發(fā)抑制Inhibition rate of spore germination (%)2.571.45±1.86b10.69±2.33d38.57±0.93c17.20±2.00d46.74±0.83c9.44±1.61d52.21±2.71c32.98±3.48d553.98±1.84c32.52±2.31c35.02±0.75d24.80±1.62c45.56±0.98cd11.72±1.90cd48.19±1.34d38.14±1.72d1051.22±1.07c35.97±1.34c33.97±0.06d27.07±0.13c44.27±0.04d14.24±0.07c42.22±2.07e45.81±2.66c2046.15±1.78d42.31±2.23b31.62±1.44e32.10±3.08b39.17±1.72e24.10±3.32b32.11±0.27f58.78±0.34b4036.67±3.06e54.17±3.82a26.61±1.73f42.87±3.72a34.27±0.56f33.60±1.09a22.16±0.30g71.55±0.39a抑制率IC50 IC50value(μL/mL)-27.49-89.41-120.53-10.10抑制率IC90IC90 value(μL/mL)-674.70-14 520.00-3 605.00-551.77

注：數(shù)值為平均值±標準差，小寫字母表示在同一列中各處理間在0.05水平上存在差異顯著性。

Note:Values are means±standard deviation (SD).Non-matching small letters at the same column indicate a significant difference among treatments (P<0.05).

2.2.2 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)油對芽管長度的抑制效果

所供試的6種揮發(fā)性物質(zhì)濃度對4種真菌芽管生長有一定的抑制效果(表3)，高濃度抑制效果顯著高于低濃度(P<0.05)。1.25 μL/mL和20～40 μL/mL揮發(fā)性物質(zhì)抑制4種真菌芽管長度表現(xiàn)為小麥根腐離蠕孢>黑曲霉>新月彎孢>總狀毛霉，揮發(fā)性物質(zhì)濃度為2.5 μL/mL的抑制大小為黑曲霉>總狀毛霉>小麥根腐離蠕孢>新月彎孢，5～10 μL/mL揮發(fā)性物質(zhì)抑制芽管生長的效果從大到小為小麥根腐離蠕孢>黑曲霉>總狀毛霉>新月彎孢。不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對真菌芽管生長在一定程度上均起抑制作用，就不同真菌而言，表明了針對不同真菌引起的病害應(yīng)選擇合適的揮發(fā)性物質(zhì)劑量。

表3 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對4種真菌孢子芽管長度的抑制作用

注：數(shù)值為平均值±標準差，小寫字母表示在同一列中各處理間在0.05水平上存在差異顯著性。

Note:Values are means±standard deviation (SD).Non-matching small letters at the same column indicate a significant difference among treatments (P<0.05).

2.3 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對細菌的抑制效果

從表4可見，所測試揮發(fā)性物質(zhì)隨著濃度的增加對供試細菌菌株的抑菌圈直徑增加，同一濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是常見食源性疾病的病原菌，而本試驗的結(jié)果表明了中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)可抑制這兩種細菌。

表4 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑(cm)

注：數(shù)值為平均值±標準差，小寫字母表示在0.05水平上不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對同一細菌抑菌圈差異顯著性(P<0.05)。

Note:Values are means ± standard deviation(SD).Different lower case letters indicate a significant effect of different concentrations of volatile substance on inhibition zones of the tested bacterium (P<0.05).

2.4 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分

從中華羊茅內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)中共檢測出400個峰(圖1)，以匹配度大于90%為標準鑒定出 32 種化合物，占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的43.54%，并通過峰面積歸一化法確定各成分的相對百分含量(表5)。中華羊茅內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)的組分復(fù)雜多樣， 以烴類6種、酯類5種、 醛類5種、醇類4種、酮類4種和吡啶類4種化合物為主。 相對含量較高的有異山梨醇(16.26%)、甲基叔丁基醚(8.18%)、二氫甘露醇(3.75%)、羥基丙酮(2.99%)、乙酸(1.22%)、己醇(1.20%)、3-糠醛(0.92%)、5-羥甲基二氫呋喃-2酮(0.86%)、5-羥基戊酸-2,4-二叔丁基苯酯(0.86%)和棕櫚酸甲酯(0.85%)，還有兩種相對含量超過10%的不確定化合物。

圖1 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.菌株揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the volatile substance of Epichlo? sp.from F.sinensis by GC-MS

表5 中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.菌株揮發(fā)性物質(zhì)化學(xué)成分GC-MS分析

續(xù)表5(Continued Tab.5)

編號No.保留時間Retention time (min)化合物Compound分子式Molecular formula相對含量Relative content (%)55.20癸烯 1-DeceneC10H200.5366.15十一烷 UndecaneC11H240.2077.92間二甲苯 Benzene,1,3-dimethyl-C8H100.0889.813-辛酮 3-OctanoneC8H16O0.79910.442,6-二甲基吡啶 2,6-LutidineC7H9N0.521011.674-甲基吡啶 Pyridine,4-methyl-C6H7N0.491111.81羥基丙酮 2-Propanone,1-hydroxy-C3H6O22.991212.87己醇 1-HexanolC6H14O1.201313.092,3-二甲基吡啶 Pyridine,2,3-dimethyl-C7H9N0.421413.39壬醛 NonanalC9H18O0.121515.433-糠醛 3-FuraldehydeC5H4O20.921615.51乙酸 Acetic acidC2H4O21.221715.833,5-二甲基吡啶 Pyridine,3,5-dimethyl-C7H9N0.421816.462-乙?；秽?Ethanone,1-(2-furanyl)-C6H6O20.571917.07反式-2-壬醛 2-Nonenal,(E)-C9H16O0.212018.085-甲基呋喃醛 2-Furancarboxaldehyde,5-methyl-C6H6O20.202118.53十六烷 HexadecaneC16H340.092225.931,4-丁二醇 1,4-ButanediolC4H10O20.082327.51羥基苯磷酸 Phosphonic acid,(p-hydroxyphenyl)-C6H7O4P0.112428.172-吡咯烷酮 2-PyrrolidinoneC4H7NO0.642531.53棕櫚酸甲酯 Hexadecanoic acid,methyl esterC17H34O20.852631.94二氫甘露醇 DianhydromannitolC6H10O43.752733.225-羥基戊酸-2,4-二叔丁基苯酯 Pentanoic acid,5-hydroxy-,2,4-di-t-butylphenyl estersC19H30O30.862835.13硬脂酸甲酯 Methyl stearateC19H38O20.192935.955-羥甲基二氫呋喃-2-酮 5-Hydroxymethyldihydrofuran-2-oneC5H8O30.863036.325-羥甲基糠醛 5-HydroxymethylfurfuralC6H6O30.253137.011,2-苯二甲酸二(2-甲基-丙基)酯 1,2-Benzenedicarboxylic acid,bis(2-methylpropyl) esterC16H22O40.063237.90異山梨醇 IsosorbideC6H10O416.263322.56不確定化合物11.723410.72不確定化合物10.97

3 結(jié)論

在離體培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物成分較為復(fù)雜，能抑制多種真菌的菌絲生長。周生亮等[4]從薯蕷根莖和種子中分離出6株內(nèi)生真菌菌株，利用生長速度法測定出6株菌株的發(fā)酵液對6種植物病原真菌有一定的抑菌效果，且隨著濃度的增加抑制作用增強。分別用甲醇、乙酸乙酯和石油醚萃取冬青衛(wèi)矛內(nèi)生真菌2QR1菌株菌絲體以及乙酸乙酯萃取發(fā)酵液得到各部分粗提物，在500 μg/mL濃度下發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對供試病原真菌抑菌活性最大，而菌絲體甲醇提取物和菌絲體石油醚提取物對個別供試病原真菌菌絲生長有較弱的抑制作用[5]。此外，Yue等[18]發(fā)現(xiàn)無性型(Neotyphodiumtembladerae)和羊茅香燭菌(Epichlo?festucae)液體培養(yǎng)物的粗提物對病原菌Cryphonectriaparasitica具有很高的抑菌活性。本研究中以中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)、乙酸乙酯粗提物、水相部分和發(fā)酵液稀釋液對小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉菌絲生長的作用(表1)，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)和乙酸乙酯粗提物抑菌活性較好，而對個別供試真菌無抑制作用，揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌作用方式還需從多方面進行試驗。

一些研究者從菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)動態(tài)方面研究內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果[6,7]。采用孢子萌發(fā)法研究黑麥草4株內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液對4種植物病原菌孢子萌發(fā)和芽管的作用，證實了內(nèi)生真菌發(fā)酵液均有明顯的抑制效果，且對小麥根腐離蠕孢抑制作用最大[7]。Holzmann-Wirth等[19]用不同的有機溶劑對草地羊茅內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)物和瓊脂培養(yǎng)基上的菌絲體進行萃取，發(fā)現(xiàn)甲醇和水提取物對大刀鐮孢的孢子具有明顯的抑制或延遲萌發(fā)的作用。而本試驗以中華羊茅內(nèi)生真菌Epichlo? sp.不同濃度揮發(fā)性物質(zhì)對小麥根腐離蠕孢、新月彎孢、黑曲霉和總狀毛霉孢子萌發(fā)率和芽管長度的作用(表2，3)，結(jié)果表明揮發(fā)性物質(zhì)對不同菌種的抑制作用具有差異性，且對總狀毛霉抑制效果最大，隨著揮發(fā)性物質(zhì)的濃度增加其抑制孢子萌發(fā)率的效果越好；揮發(fā)性物質(zhì)對四種供試真菌芽管生長有一定的抑制效果，且高濃度抑制效果顯著高于低濃度。由此可見，內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對孢子萌發(fā)和芽管長度有抑制作用，就揮發(fā)性物質(zhì)而言，針對不同真菌引起的病害應(yīng)選擇合適的揮發(fā)性物質(zhì)劑量。

內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對某些真菌和細菌均有一定的抑菌效果。采用水蒸氣蒸餾法獲得尖瓣海蓮葉內(nèi)生真菌Penicilliumsp.B21揮發(fā)性物質(zhì)，以揮發(fā)性物質(zhì)的10和20 mg/L濃度處理，在20 mg/L時對大腸埃希氏菌和白色葡球菌有較好的抑菌效果[20]。解修超等[21]采用索氏提取法提取三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26的揮發(fā)性物質(zhì)，用濾紙片擴散法測定不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制作用，濃度為1 000.0 mg/mL時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性較高，而對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌抑制作用較弱。本試驗以濾紙片法測得不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑的作用(表4)，在40 μL/mL時抑菌圈直徑顯著大于對照(P<0.05)。從這些研究中發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)生真菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對細菌或真菌的抑制效果因菌種不同而異，可能是揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量存在差異性。

通常利用GC-MS技術(shù)測定內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)的組分種類和相對含量。三尖杉內(nèi)生真菌SR1-26揮發(fā)性物質(zhì)主要為油酸、棕櫚酸和油酸乙酯等化合物[21]，尖瓣海蓮葉內(nèi)生真菌Penicilliumsp.B21揮發(fā)性物質(zhì)主要為棕櫚酸、丁基-異丁基-鄰苯酸二甲酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯和硬脂酸[20]，菠蘿內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)主要為2-甲基-丙酸甲酯、2-甲基丙酸、3-甲基丁醇、乙酸異戊酯、2-甲基丙酸-2-甲基丁酯和乙醇[22]。由此可見，不同內(nèi)生真菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)組分和含量均存在一定的差異性。本試驗的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)固相微萃取-氣相質(zhì)譜分析后，發(fā)現(xiàn)色譜峰數(shù)量較多(圖1)，而以匹配度高的質(zhì)譜峰為標準僅鑒定出32種組分，占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的43.54%，其中與抑菌活性的相關(guān)的化合物有乙酸、1,4-丁二醇、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯等物質(zhì)[22-24]。異山梨醇是一種滲透性口服脫水利尿藥，可作為聚合物改性及可降解聚合物制造的生物原料[25]；甲基叔丁基醚可應(yīng)用于清潔汽油辛烷值改進劑[26]；還有二種組分含量超過10%的不能通過數(shù)據(jù)庫檢索確定(表5)，這些匹配度較低的化合物有待進一步分離、鑒定。

總體上，目前的研究主要采用乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇和石油醚等有機溶劑萃取內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物，研究其對孢子萌發(fā)率、芽管長度、菌絲生長、菌絲形態(tài)和細菌等方面的作用，涉及內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)部分對上述測定指標的研究還不多。而本試驗從多個角度測定了中華羊茅內(nèi)生真菌揮發(fā)性物質(zhì)對微生物的作用，可為開發(fā)新的生物制劑提供一定的試驗依據(jù)。