康林芝，熊榮園，金磊，唐惠妍

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005；2.南充職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川南充637000；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東廣州510640）

原生質(zhì)體融合技術(shù)無細胞壁障礙，細胞融合頻率高，從而使基因重組的頻率也高，具有許多常規(guī)雜交所不具有的優(yōu)勢。細胞融合技術(shù)是改進品種風(fēng)味和創(chuàng)造新品種的有效方法之一，近年來，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食用菌育種和基礎(chǔ)研究并取得了可喜的成績，在我國、日本和西歐的研究進展較快[1-2]。至今為止，國內(nèi)外學(xué)者已從杏鮑菇Pleurotus eryngii、香菇Lentinus edodes （Berk.）Pegler、 金 針 菇 Flammulina velutipes（Curt.）Singer、平菇 Pleurotus ostreatus、草菇 Volvariella volvacea（Bull.）Singer、靈芝 Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst 等多種食用菌中成功制備原生質(zhì)體，在食用菌育種方向進行了大量的研究，取得了令人矚目的進展[3-5]。而且融合雜交既可發(fā)生在種內(nèi)，也可發(fā)生在種間和屬間，對于參與融合的親本株，可以不需要特殊的遺傳標記或精確的遺傳分析，這對生產(chǎn)實踐中食用菌新品種選育和食用菌遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究具有十分重要的意義。

平菇含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，每百克干品含蛋白質(zhì)20 g～23 g，而且氨基酸成分種類齊全，礦物質(zhì)含量十分豐富。中溫型平菇子實體分化最適宜的溫度范圍20 ℃～24 ℃，菌絲體在3 ℃仍可以生長。金針菇菌蓋滑嫩、菌柄細長脆嫩，形美，味鮮，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類豐富，并含有多種維生素和各種微量元素，還含有抗癌和提高免疫功能的活性物質(zhì)，是一種深受人們喜愛的食藥用菌。因此，金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品，具有相當(dāng)廣闊的開發(fā)前景。但是金針菇屬于低溫結(jié)實型的食用菌，生長環(huán)境內(nèi)的低溫氣候條件，是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。金針菇菌絲體在溫度高于34 ℃則停止生長，甚至死亡；子實體發(fā)育適宜溫度為8 ℃～13 ℃，如果溫度高于20 ℃則無法正常形成原基或子實體，甚至無原基形成。智能化工廠栽培金針菇，整個生育期內(nèi)需要制冷設(shè)備制冷控溫，能源消耗大，培育成本高。為了解決這些突出矛盾，創(chuàng)造豐富多樣的金針菇種質(zhì)資源、節(jié)約能源消耗和降低生產(chǎn)成本，選育適用于反季節(jié)人工栽培和節(jié)能型工廠化生產(chǎn)高溫型金針菇優(yōu)良品種就顯得尤為重要。

本研究選取耐低溫、代謝能力強的白色金針菇與高產(chǎn)量白色平菇進行遠緣親本的原生質(zhì)體融合，試圖在遠緣親本原生質(zhì)體融合及融合子鑒定等方面做一些探討，為食用菌在細胞水平上的雜交育種提供參考。

1 材料

1.1 供試菌株

金針菇（F1）和平菇（P8）菌種是韶關(guān)學(xué)院微生物研究室-80 ℃保存的2 株商品化栽培品種。

1.2 培養(yǎng)基配制

液體PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮后稱取200 g，加水500 mL，煮沸 10 min～20 min，3 層紗布過濾，取濾液備用。向濾液中加入20 g 葡萄糖，3 g 磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂充分溶解后加水至1 000 mL，pH 5.5～6.0，分裝于各錐形瓶中121 ℃滅菌20 min 備用。

固體PDA 培養(yǎng)基：液體PDA 培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂即可制成固體培養(yǎng)基，pH5.5～6.0，分裝于各錐形瓶中121 ℃滅菌20 min 備用。

原生質(zhì)體再生液體培養(yǎng)基：10 g 麥芽糖，4 g 葡糖糖，4 g 酵母粉，溶于0.6 mol/l KCl 滲透壓穩(wěn)定劑中，加水定容至總體積為1 000 mL，分裝于各錐形瓶中121 ℃滅菌20 min 備用，此培養(yǎng)基用于原生質(zhì)體再生。

原生質(zhì)體再生固體培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基中加入20 g 瓊脂即可制成固體培養(yǎng)基，pH5.5～6.0，分裝于各錐形瓶中121 ℃滅菌20 min 備用。

1.3 酶液配制

溶壁酶：廣東微生物所提供，用0.6 mol/L KCl 滲透壓穩(wěn)定劑配制濃度為1.5%酶液，輕輕搖勻，使得溶壁酶充分溶解，無菌條件下再用0.45 μm 微孔濾膜過濾除菌，收集濾液。

蝸牛酶：廣東微生物所提供，用0.6 mol/L KCl 滲透壓穩(wěn)定劑配制濃度為1.5%酶液，輕輕搖勻，使得蝸牛酶充分溶解，無菌條件下再用0.45 μm 微孔濾膜過濾除菌，收集濾液。

1.4 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）融合劑配制

稱取5 g 的PEG-4000 粉末，加入適量超純水和0.2 mL 1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH7.5）、1 mL 1 mol/L CaCl2溶液，加熱至60 ℃，溶解充分后定容至20 mL，2 μm 孔徑濾膜過濾除菌，用2.0 mL 無菌離心管分裝，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 主要儀器設(shè)備

智能恒溫震蕩培養(yǎng)箱（ZHP-250 型）：上海三發(fā)科學(xué)有限公司；分析天平（BS124S）：賽多利斯（北京）公司；臺式高速離心機（TGL20M-Ⅱ）：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；電子顯微鏡（BM1000）：南京江南永新光學(xué)有限公司；超純水過濾裝置（022246）：RES.JSCIENTIFIC INSTRUMENTSCO.LTD；超凈工作臺（SWCJ-ICW）：蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

2 試驗方法

2.1 菌絲體培養(yǎng)

將金針菇（F1）和平菇（P8）菌絲接種于平板，待長滿平板后，切取最前端生長旺盛的菌絲分別轉(zhuǎn)接到50 mL 的PDA 液體培養(yǎng)基中，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，在無菌條件下將已培養(yǎng)好的菌絲置于刻度離心管中，挑出培養(yǎng)基塊，用無菌水和滲透壓穩(wěn)定劑各沖洗3 次，4 000 r/min 離心10 min，棄上清液收集菌絲體，待用。

2.2 原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體的制備參照文獻[6-9]。收集到的菌體分別用無菌水和穩(wěn)滲劑清洗，吸干，稱重，按酶液（溶壁酶與蝸牛酶酶液按體積比1 ∶1 混勻）與菌絲為 1 ∶150（g/mL）加酶解液，置30 ℃下恒溫酶解3 h，隔時搖動，并鏡檢原生質(zhì)體釋放情況。酶解完畢后，濾液于4 000 r/min離心10 min，棄上清液收集沉淀，用0.6 mol/L 穩(wěn)滲劑洗滌2 次，并加2 mL 0.6mol/L 穩(wěn)滲劑充分混溶稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)，備用。

2.3 原生質(zhì)體的滅活

平菇（P8）原生質(zhì)體采用水浴法100 %滅活，取純化后的原生質(zhì)體懸液4 mL 于10 mL 無菌離心管中，置于65 ℃恒溫水浴中滅活30 min，其間不斷搖動離心管使之均勻受熱。

2.4 金針菇與平菇原生質(zhì)體的融合與再生

原生質(zhì)體的融合與再生參照文獻[10-15]。將上述制備好的金針菇（F1）和平菇（P8）原生質(zhì)體溶液各1 mL 混勻后于3 000 r/min 離心10 min，棄上清，加2 mL 25 %PEG 和0.2 mol/L CaCl2溶液助融劑，混勻后于32 ℃下溫育25 min，之后冰浴20 min，隨后離心，去除融合劑，用穩(wěn)滲劑清洗2 次，加入再生液體培養(yǎng)基在冰上放置10 min。25 ℃靜置培養(yǎng)2 d 隨后采用涂布法涂布于固體PDA 培養(yǎng)基平板再生，置34 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后觀察計數(shù)。

2.5 融合子鑒定

對可在34 ℃培養(yǎng)箱中生長的菌落，進一步進行菌落表型、索狀聯(lián)合和拮抗試驗進行鑒定。經(jīng)過鑒定之后選取與母種具有明顯形態(tài)差異，具有拮抗性且具有鎖狀聯(lián)合的菌株來進行出菇試驗，出菇試驗是在恒溫17 ℃條件下培養(yǎng)[16-17]，常規(guī)管理，以此來鑒定融合子菌株。

3 結(jié)果與分析

3.1 金針菇和平菇原生質(zhì)體的制備

在前期研究的基礎(chǔ)上，以菌齡5 d 的菌絲體為原料，采用1.5%溶壁酶和1.5%蝸牛酶（體積比1 ∶1），置30 ℃下恒溫酶解3 h，0.6 mol/L KCl 溶液為滲透壓穩(wěn)定劑，制備得到平菇與金針菇原生質(zhì)體，利用顯微鏡對其觀察，結(jié)果如圖1。

圖1 平菇和金針菇原生質(zhì)體（×10）Fig.1 Protoplasts from Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus（×10）

可以看出此方法下金針菇及平菇都可以獲得較好的原生質(zhì)體得率，可繼續(xù)進行下一步融合研究。

3.2 熱滅活平菇及金針菇原生質(zhì)體再生情況

為了驗證平菇原生質(zhì)體熱滅活效果及金針菇原生質(zhì)體再生情況，進行了金針菇和滅活平菇的再生試驗，利用1 mL 稀釋的金針菇和滅活平菇原生質(zhì)體涂布在原生質(zhì)體再生固體培養(yǎng)基平板，結(jié)果如圖2。

圖2 金針菇和平菇原生質(zhì)體再生情況Fig.2 Regeneration between Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus Protoplasts

培養(yǎng)10 d 后發(fā)現(xiàn)金針菇原生質(zhì)體活性很高，出現(xiàn)大量再生菌落。而滅活平菇原生質(zhì)體未出現(xiàn)再生菌落，表明平菇原生質(zhì)體全部失去再生活性。

3.3 融合子的再生

本試驗用置34 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為標記篩選出融合子，即滅活后的平菇原生質(zhì)體與金針菇原生質(zhì)體只有異源互補的融合子才能在34 ℃下再生。兩原生質(zhì)體混勻后加助融劑融合，涂布平板再生，若能再生出菌落，則基本能夠鑒定為融合子，本研究獲得18 個可在34 ℃生長的單菌落，結(jié)果見圖3。

圖3 融合子、金針菇和平菇原生質(zhì)體在34 ℃條件下培養(yǎng)生長情況Fig.3 Fusant，F(xiàn)lammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus protoplast culture at 34 ℃

3.4 融合子的鑒定

挑取在34 ℃培養(yǎng)可生長的菌落轉(zhuǎn)接至平板，置于25 ℃培養(yǎng)后選取1 株菌絲體形態(tài)明顯差別與親本的融合子，稱為F1P8 金針菇菌株，見圖4。

由圖4 可知，融合子菌絲比金針菇母種菌絲更加致密，更加潔白，更加有質(zhì)感。同時與親本平菇相比，氣生菌絲相對較短，質(zhì)感不夠強，但比平菇菌絲致密。

圖4 融合子F1P8 和親本金針菇、平菇的菌絲形態(tài)比較Fig.4 Colony characteristics of fusant and parent strain Flammulina velutipes（Curt.）Singer and Pleurotus ostreatus

對于所挑取到的菌落進行的拮抗試驗觀察見圖5。

圖5 融合子F1P8 和親本金針菇（F1）、平菇（P8）的拮抗性鑒定Fig.5 Antagonistic effect observations between fusant and Flammulina velutipes(Curt.)Singer and Pleurotus ostreatus

如果融合子有別于兩親本，則與親本菌落間應(yīng)形成對峙帶即拮抗線。金針菇、平菇和F1P8 融合子3 個菌株間存在一定的拮抗性，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多，兩親本與融合子的菌絲會繼續(xù)生長，但沒有出現(xiàn)交叉生長的情況，充分說明了菌種間具有的差異性。

將上面獲得的菌株進行插片培養(yǎng)，4 d 后，菌絲鋪滿插在培養(yǎng)基上面的蓋玻片。小心取出蓋玻片，直接放置在顯微鏡下鏡檢。經(jīng)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，F(xiàn)1P8菌株具有鎖狀聯(lián)合的菌株，說明擬融合子是雙核菌株，可以進行正常出菇。菌絲的鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖6 融合子鎖狀聯(lián)合觀察Fig.6 The observation of putative fusant strain F1P8 clamp connection

經(jīng)過擬融合子初步篩選，我們將篩選的擬融合子進行出菇試驗，如圖7。

圖7 親本金針菇（F1）和融合子金針菇（F1P8）的出菇情況Fig.7 Fruiting experiment of Flammulina velutipes（Curt.）Singer and fusant strain F1P8

由圖7 可以觀察到擬融合子菌株與原種相比較不易開傘、菇體粗壯、菇形整齊，出菇數(shù)目較多。出菇試驗表明，金針菇（F1）和平菇（P8）融合之后產(chǎn)生了市場前景好的子實體為白色的、原基形成較多，產(chǎn)量有所提高、菇形好的金針菇新品種，我們命名為金針菇F1P8。

4 結(jié)論

金針菇與平菇兩種原生質(zhì)體融合的最佳條件為：熱滅活平菇原生質(zhì)體1 mL（1×107/mL），加入金針菇原生質(zhì)體 1 mL（1×107/mL），再加入 2 mL 25 %PEG 融合劑，在32 ℃下溫育25 min，之后冰浴20 min，隨后離心，去除融合劑，用穩(wěn)滲劑清洗2 次，加入再生液體培養(yǎng)基在冰上放置10 min，25 ℃靜置培養(yǎng)2 d 隨后涂布于再生培養(yǎng)基，金針菇與平菇原生質(zhì)體融合的效果較好。平菇原生質(zhì)體置于65 ℃恒溫水浴中滅活30 min，致死率達100%。

融合子與兩親本的菌落表型明顯不同，在菌絲形態(tài)以及出菇試驗的子實體形態(tài)都有所不同，并且融合子與兩親本有一定的拮抗性。但是耐高溫特性在傳代過程中丟失，說明遠緣親本原生質(zhì)體融合所得融合子遺傳不穩(wěn)定，仍需要不斷探索。平菇、金針菇都是典型的四極性擔(dān)子菌，其可育性菌體為雙核單倍體，這不同于雙倍體的植物細胞，核行為有其特殊性，在整個營養(yǎng)生長階段和子實體生長發(fā)育前期，菌體細胞中的2 個異源核是各自獨立分裂的。因此，只要2 個異源核能在菌體生長過程中同步分裂，均等分配，就能形成穩(wěn)定的融合子。這可能是本研究融合子最終丟失耐高溫遺傳性狀的原因。擔(dān)子菌遠緣親本原生質(zhì)體融合為食用菌育種提供了廣闊前景，但尚未達到定向選育水平，融合子的遺傳特性表達將是有待重點研究的問題[18]。