(1.貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2.貴陽市農(nóng)業(yè)試驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550003)

赫章櫻桃(Prunuspseudocerasus‘Hezhang’)是貴州重要的櫻桃種質(zhì)資源，具有可溶性固形物含量高、產(chǎn)量高及口感好等優(yōu)點(diǎn)，是遺傳育種的重要資源。但目前，田間植株疑似有病毒感染，且資源破壞變得越來越嚴(yán)重，因此，需要建立有效的方法進(jìn)行資源保存。資源保存的傳統(tǒng)方法是田間保存，需要大量的土地、勞力及財(cái)力投入，且容易遭受病蟲害、動(dòng)物及自然災(zāi)害的破壞[1]。離體保存的確是資源保存的安全方法，能避免傳統(tǒng)方法的不足之處，亦是良種、轉(zhuǎn)基因材料及突變植株保存的有效方法[2]。

離體保存分為短期保存(離體快繁)、中期保存(緩慢生長保存)和長期保存(超低溫保存)。短期保持需要頻繁的繼代，增加了勞動(dòng)力成本和體細(xì)胞無性系變異的幾率，而中期保存和長期保存后能克服這些問題，但超低溫保存不僅技術(shù)要求高，且需要持續(xù)消耗液氮，這限制了其應(yīng)用[1,3]。然而，中期保存操作相對(duì)簡(jiǎn)單易行，只需要常規(guī)組培室或培養(yǎng)箱即可進(jìn)行[4]，且能通過再生培養(yǎng)快速獲得大量植株，避免田間植株供應(yīng)不足的情況[5]。中期保存常通過降低培養(yǎng)溫度[6-7]、增加滲透調(diào)節(jié)劑[8]、增加生長抑制劑或減少植物生長調(diào)節(jié)劑[4,9]，以及多種方法綜合應(yīng)用達(dá)到培養(yǎng)的目的。如今，許多植物已實(shí)現(xiàn)中期保存(緩慢生長保存)，包括半夏[10]、百合[11]、蘋果[12-13]、馬鈴薯[14]、鬼臼[15]、葡萄[16-17]等。盡管許多學(xué)者探討了櫻桃的離體快繁方法[18-26]，但有關(guān)緩慢生長保存的報(bào)道卻很少，目前能查閱的僅知Janeiro等[27]將野櫻桃在2 ℃下保存了1年，卻未見有關(guān)中國櫻桃的報(bào)道。

鑒于櫻桃種質(zhì)資源的重要性，本文采用赫章櫻桃組培苗的莖尖繁殖單芽姊妹系進(jìn)行緩慢生長保存，同時(shí)采用ISSR標(biāo)記檢測(cè)組培苗的遺傳穩(wěn)定性，以期為櫻桃資源保存提供更多參考方法。

1 材料及方法

1.1 緩慢生長保存

2009年6月至2010年12月以貴州省赫章縣的櫻桃種質(zhì)組培苗為材料，在MS + 2.0 mg·L-1BA + 0.5 mg·L-1IBA + 30 g·L-1蔗糖 + 0.7%瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d后繼代，以此建立單芽姊妹系，2010年12月底選取1.0～1.5 cm高的植株用于緩慢生長保存，保存至2011年8月，培養(yǎng)溫度25 ℃。緩慢生長保存設(shè)置以下培養(yǎng)基：1)礦質(zhì)元素影響。以MS、1/2 MS和1/4 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，均添加2%蔗糖(表1)，培養(yǎng)溫度為6 ℃。2)PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和溫度的影響。以1/2 MS + 0.5 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1IBA+20 g·L-1蔗糖 + 40 g·L-1甘露醇 + 0.7%瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0、400 mg·L-1PVP后置于6 ℃和25 ℃培養(yǎng)(表1)。3)蔗糖和ABA(脫落酸)的影響。以1/2 MS + 0.5 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1IBA + 400 mg·L-1PVP + 0.7%瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0%、2%、4%及6%蔗糖或0，1，2 mg·L-1和3 mg·L-1ABA后置于25 ℃培養(yǎng)(表1)。4)甘露醇的影響。以1/2 MS + 0.5 mg·L-1BA + 0.1 mg·L-1IBA + 20 g·L-1蔗糖 + 400 mg·L-1PVP + 0.7%瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0%、2%、4%及6%甘露醇后置于25 ℃培養(yǎng)(表1)。每個(gè)處理接種5株試管苗，重復(fù)8次。

表1 各種物質(zhì)對(duì)赫章櫻桃緩慢生長保存的影響

注：同列相同字母表示經(jīng)鄧肯氏多重極差檢驗(yàn)在0.05水平上差異不顯著。

每個(gè)接種瓶(約250 mL)中放置50 mL培養(yǎng)基，然后用1層牛皮紙和1層聚乙烯膜進(jìn)行封口，所有培養(yǎng)基pH值均為5.8，經(jīng)121 ℃高溫滅菌20 min后用于接種，光照時(shí)間為14 h[33μmol·(m2·s)-1]。分別于培養(yǎng)4、6個(gè)月和8個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率，8個(gè)月后統(tǒng)計(jì)增殖率及植株生長勢(shì)，隨后組培苗將在MS+2.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+0.7%瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)再生率。植株生長勢(shì)分為0～5級(jí)：0級(jí)為死亡；1級(jí)為褐色，部分黃化；2級(jí)為植株矮小，有淡綠色至綠色葉片；3級(jí)為植株矮小，有深綠色葉片和莖，無根；4級(jí)為植株高大，有綠色葉片和莖，無根；5級(jí)為植株高大，有深綠色葉片和莖，有根。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件，成活率、增殖率用單因素方差分析差異顯著性，并進(jìn)行Tukey’s HSD檢測(cè)，再生率采用t檢測(cè)差異顯著性，數(shù)據(jù)處理前進(jìn)行方差齊性檢測(cè)。

1.2 遺傳穩(wěn)定性的ISSR檢測(cè)

2011年9月取各處理保存前后的組培苗數(shù)株，取其葉片分別建立各處理混合樣本，采用北京天根公司生產(chǎn)的Plant Genomic DNA Kit(DP 305-03)試劑盒提取混合樣本基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量及濃度，稀釋至20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩SSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的序列(http：//zhidao.baidu.com/question/141178305.html)，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)從90條ISSR引物中篩選獲得13條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性及穩(wěn)定性好的引物用于遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)(表1)。PCR擴(kuò)增體系為(總體積20μL)：引物1.0 mmol·L-1，DNA模板2.5 mg·μL-1，Tagmix(天根生化科技北京有限公司)10.0μL-1，甲酰胺0.5μL-1。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，49.1～56 ℃(溫度因引物不同而異)退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在含EB的1.5%瓊脂糖凝膠中以90 V恒定電壓電泳1 h左右，DL 2000 Marker(天根生化科技北京有限公司)為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，紫外凝膠成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦質(zhì)元素、溫度和PVP對(duì)試管苗保存的影響

礦質(zhì)元素與植物保存有很大關(guān)系，但對(duì)櫻桃成活率無顯著影響，對(duì)再生率有顯著影響(表2)。保存至4個(gè)月時(shí)，MS培養(yǎng)基上櫻桃的成活率最高(80%)，6個(gè)月時(shí)急劇降至50%，8個(gè)月僅40%，而1/2 MS、1/4 MS培養(yǎng)基上櫻桃的成活率在4個(gè)月時(shí)分別為55%、60%，但隨后幾乎無變化。8個(gè)月后，MS培養(yǎng)基上櫻桃的再生率為0，而1/2 MS、1/4 MS的的再生率分別為37.5%、54.17%。在生長勢(shì)上，4個(gè)月時(shí)各處理櫻桃苗均矮小，葉濃綠色，無增殖；6個(gè)月后，以1/4 MS的苗最優(yōu)，相對(duì)高大，葉綠至濃綠色，無根，1/2 MS的苗幾乎無變化，僅有1株生根，而MS的苗為淡綠色；8個(gè)月時(shí)MS的苗為淡綠色和黃色，近死亡(圖1-16)。因此，低溫下，礦質(zhì)元素含量較低時(shí)更利于櫻桃緩慢生長保存。

表2 ISSR檢測(cè)13條引物的退火溫度及其擴(kuò)增結(jié)果

低溫是植物緩慢生長保存的重要方式，PVP是一種有效的抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)將二者進(jìn)行交互處理，結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度對(duì)櫻桃保存有顯著影響(表1)。保存前6個(gè)月，6 ℃下櫻桃的成活率高于25 ℃下的成活率。在4個(gè)月時(shí)，6 ℃下櫻桃的成活率為100%，25 ℃下的成活率為65%；在6個(gè)月時(shí)，6、25 ℃下的成活率分別為95%、65%；在8個(gè)月時(shí)，6 ℃下的成活率急劇降至65%，但25 ℃下的成活率幾乎無變化(60%)；8個(gè)月后，25 ℃下櫻桃的再生率顯著高于6 ℃下的再生率，分別為66.67%和12.5%。二者生長勢(shì)以25 ℃下為好(圖1-13、圖1-14)。因此，在培養(yǎng)基添加物質(zhì)較多的情況下，25 ℃比低溫更適合櫻桃緩慢生長保存。

PVP對(duì)櫻桃中長期保存后的再生率有積極作用(表1)。高溫下(25 ℃)，在培養(yǎng)初期(4個(gè)月時(shí))，PVP對(duì)櫻桃成活率有抑制作用，無PVP時(shí)為95%，而有PVP時(shí)僅為65%，但隨保存時(shí)間的延長，無PVP時(shí)成活率急劇下降，6個(gè)月和8個(gè)月時(shí)分別為75%和55%，而有PVP的幾乎沒有變化。從生長勢(shì)上看，6個(gè)月前，有PVP上的苗葉色濃于無PVP者，無增殖；8個(gè)月時(shí)，無PVP的反而為濃綠色，苗矮小，有莖較粗，增殖約4倍。但從再生率考慮，8個(gè)月后無PVP的僅為12.5%，顯著低于添加PVP的(67%)。低溫下(6 ℃)，PVP在培養(yǎng)初期(4個(gè)月時(shí))可顯著提高成活率，有PVP時(shí)櫻桃成活率為100%，無PVP時(shí)僅為55%，且有PVP的一直優(yōu)于無PVP的，再生率和苗生長勢(shì)亦如此(圖1-12、圖1-14)。因此，櫻桃中長期保存時(shí)添加PVP可提高再生率。

2.2 蔗糖和甘露醇對(duì)櫻桃緩慢生長保存的影響

蔗糖是離體保存的重要滲透調(diào)節(jié)劑和碳源，有無蔗糖對(duì)櫻桃緩慢生長有顯著影響，但濃度的高低對(duì)其成活率無顯著影響(表1)。保存4個(gè)月時(shí)，無蔗糖培養(yǎng)基上櫻桃成活率僅有30%，而2%～6%蔗糖培養(yǎng)基上成活率為70%以上，隨后均略有下降；保存到8個(gè)月時(shí)，無蔗糖培養(yǎng)基上櫻桃已全部死亡，其余為65%及以上。再生率以2%蔗糖稍高(85.42%)，其次是4%蔗糖(80%)，最后是6%蔗糖(76.77%)。對(duì)生長勢(shì)而言，無蔗糖時(shí)櫻桃苗葉色淡綠或黃色，植株矮小，略有增殖；2%和4%蔗糖時(shí)苗相對(duì)高大，健壯，葉綠至濃綠色，增殖較多。在4個(gè)月時(shí)，2%蔗糖培養(yǎng)基上有多株生根；在8個(gè)月時(shí)，二者都有生根；6%蔗糖培養(yǎng)基上苗相對(duì)矮小，葉濃綠色，增殖較少，無根(圖1-1、圖1-2、圖1-3)。因此，選擇2%～4%的蔗糖為好。

甘露醇也是離體保存常選擇的碳源，對(duì)櫻桃中期保存有顯著的影響(表1)。4個(gè)月時(shí)，6%甘露醇培養(yǎng)基上櫻桃的成活率顯著高于其余濃度，但6個(gè)月時(shí)降至60%，8個(gè)月時(shí)急劇降至35%，其余幾乎保持不變。無甘露醇時(shí)再生率為85.42%，2%甘露醇時(shí)為83.33%，顯著高于4%甘露醇(67%)和6%甘露醇(0)時(shí)。由圖1-4、圖1-5、圖1-6可見，在生長勢(shì)上，無甘露醇時(shí)苗相對(duì)高大健壯，葉綠至濃綠色，增殖多，有生根；2%和4%甘露醇時(shí)相對(duì)較矮，葉濃綠色，增殖少，無根，而6%甘露醇時(shí)更矮，葉淡綠至綠色，增殖少，且有玻璃化現(xiàn)象；4%蔗糖培養(yǎng)基與2%蔗糖+2%甘露醇培養(yǎng)基上的苗相比，生長勢(shì)更好。因此，甘露醇以不超過2%為宜。

2.3 ABA對(duì)櫻桃緩慢生長保存的影響

適當(dāng)添加ABA對(duì)櫻桃中期保存有積極作用(表1)。

注：1～3是添加2%、4%和6%蔗糖植株；4～6是添加2%、4%和6%甘露醇植株；7～10是添加1、2 mg·L-1 和3 mg·L-1ABA植株(9和10是添加3 mg·L-1 ABA植株)；11是添加3%甘油植株(數(shù)據(jù)未列出)；12是添加400 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；13是添加0 mg·L-1 PVP于25 ℃保存的植株；14是添加0 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；15～17是在1/2 MS、MS和1/4 MS上保存的植株。圖1 赫章櫻桃緩慢生長保存8個(gè)月后的植株

注：泳道M為分子量標(biāo)記，1～16泳道分別代表以下處理的單芽姊妹系植株：1是保存前；2～4是添加2%、4%和6%蔗糖植株；5～7是添加2%、4%和6%甘露醇植株；8～10是添加1、2 mg·L-1和或3 mg·L-1 ABA植株；11是添加400 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；12是添加0 mg·L-1 PVP于25 ℃保存的植株；13是添加0 mg·L-1 PVP于6 ℃保存的植株；14～16是在1/2 MS、MS和1/4 MS上保存的植株。圖2 緩慢生長保存的遺傳穩(wěn)定性

在4個(gè)月時(shí)，無ABA培養(yǎng)基上櫻桃的苗成活率僅30%，而添加ABA后，苗成活率除3 mg·L-1ABA為40%外，其余為80%以上；在6個(gè)月時(shí)，1 mg·L-1及4 mg·L-1ABA上苗成活率急劇降至60%，而2 mg·L-1ABA上為80%；8個(gè)月時(shí)，1 mg·L-1及4 mg·L-1ABA培養(yǎng)基上櫻桃的苗成活率進(jìn)一步降至35%和45%，而2 mg·L-1ABA培養(yǎng)基上苗成活率為70%。盡管2 mg·L-1ABA培養(yǎng)基上的苗成活率顯著高于1 mg·L-1ABA上的，但其再生率卻顯著低于1、4 mg·L-1培養(yǎng)基上的。從生長勢(shì)上看(圖1-7、圖1-8、圖1-9、圖1-10)，無ABA的苗矮小，葉淡綠色，部分黃色，而有ABA的苗均高大，葉淡綠至綠色，葉片寬大，冠幅大，增殖極少，無根。因此，適量的ABA可以延長櫻桃保存。

2.4 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

圖2為赫章櫻桃緩慢生長保存中的ISSR檢測(cè)電泳圖(引物815)，由圖2可見，保存前后的15個(gè)處理中，13條ISSR引物共獲得97個(gè)位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)特異條帶，平均每條引物獲得7.5個(gè)位點(diǎn)。使用目前的中期保存辦法，經(jīng)過240 d的培養(yǎng)并未檢測(cè)到體細(xì)胞無性系變異。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫下礦質(zhì)元素含量較低時(shí)更利于櫻桃緩慢生長保存。原因可能是低溫下植物新陳代謝變慢，因?yàn)榈蜏叵录?xì)胞膜積累了不飽和脂肪酸，后者使細(xì)胞膜變薄并阻止細(xì)胞分裂和伸長[28-29]。Kotuby等[30]認(rèn)為櫻桃對(duì)鹽敏感。低溫下，如果培養(yǎng)基中有較多的礦質(zhì)元素，也許起初植物能吸收并利用，但隨著時(shí)間延長，新陳代謝的減弱，植物體內(nèi)會(huì)積累過多的礦質(zhì)元素，從而形成毒害。因此，我們認(rèn)為1/4 MS和1/2 MS比MS更適合櫻桃在低溫下進(jìn)行保存。雪松莖尖保存時(shí)，也以1/2 MS和1/4 MS為好[31]。蘋果在低溫下以1/4 MS為好[13]。低溫培養(yǎng)是一種植物緩慢生長保存的主要方式，且有效應(yīng)用于多種果樹[12,32-35]，本研究發(fā)現(xiàn)，無論培養(yǎng)基中有無PVP，櫻桃在25 ℃下比6 ℃下表現(xiàn)更好，特別是苗生長勢(shì)和再生率。可能此時(shí)培養(yǎng)基有很多營養(yǎng)物質(zhì)，低溫不利于櫻桃保存，原因與上述一致。Janeiro等發(fā)現(xiàn)，野櫻桃低溫冷藏時(shí)間越長，增殖能力越低[27]。El-Ashry等發(fā)現(xiàn)，低溫不利于2種棗椰樹的中期保存[6]。同時(shí)，Watt等認(rèn)為，低營養(yǎng)水平的培養(yǎng)基并不適合甘蔗的中長期保存[36]。也許其他方式更適合櫻桃緩慢生長保存，比如PVP便能增加組培苗再生率，滲透調(diào)節(jié)劑的濃度和種類對(duì)植物保存尤為重要。

合適滲透調(diào)節(jié)劑種類和濃度將大大提高保存效果，蔗糖為首選物質(zhì)，其次是甘露醇[37]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2%～4%的蔗糖對(duì)櫻桃緩慢生長保存更好，而非6%蔗糖。高濃度的蔗糖并不利于小豆中期保存[38]。Neveen等將葡萄緩慢生長保存1年，2%和6%的蔗糖分別獲得66.66%和33.33%成活率[16]。Pan等也發(fā)現(xiàn)，6%蔗糖培養(yǎng)基上的葡萄培養(yǎng)8個(gè)月便全部死亡[17]。但本實(shí)驗(yàn)保存8個(gè)月時(shí)，4%和6%蔗糖上的植株仍有約70%的成活率，也許櫻桃比葡萄更能適應(yīng)高濃度蔗糖，原因可能是不同的植物對(duì)水分需求不一樣所致，櫻桃更耐旱。幾乎已有報(bào)道均認(rèn)為植物更適合低濃度的蔗糖，Shibli等認(rèn)為，原因可能是蔗糖主要是作為碳源，而非滲透調(diào)節(jié)劑[37]，筆者認(rèn)為也許高濃度的蔗糖使培養(yǎng)基滲透式升高，使得植株不能吸收足夠水分以供生長。甘露醇雖然是一種可用的滲透調(diào)節(jié)劑，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超過2%的甘露醇便不利于櫻桃緩慢生長保存，且完全使用蔗糖比蔗糖和甘露醇混合使用效果更好。鬼臼緩慢生長保存加入蔗糖和甘露醇后植株黃化，二者單獨(dú)或混合使用濃度到4%時(shí)，成活率及再生率均下降，并認(rèn)為甘露醇對(duì)植株有毒害性[15]。雖然甘露醇能抑制植株生長，但多種蘋果保存顯示甘露醇單獨(dú)使用不利于緩慢生長保存，保存時(shí)間僅約3個(gè)月[13,39]。狹葉香[9]和番紅花[40]緩慢生長保存時(shí)也不適應(yīng)高濃度甘露醇，植株高度隨著濃度升高而降低。Neto和Otoni認(rèn)為，甘露醇含量的增加引起植株碳水化合物毒害或滲透壓過高[41]。

ABA是一種生長抑制劑，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加少量的ABA有利于櫻桃緩慢生長保存，尤其是使組培苗增高，但其他效果并不理想。Kovalchuk等也認(rèn)為，部分蘋果種質(zhì)緩慢生長保存時(shí)無ABA更好[13]。培養(yǎng)基添加0.5 mg·L-1ABA培養(yǎng)基上保存1年的白草蒿可再生，但2.0 mg·L-1ABA時(shí)不能再生[8]。狹葉香再生率隨ABA濃度升高而急劇下降[9]。樹胡椒組培苗的各項(xiàng)指標(biāo)都隨ABA濃度的升高而下降[42]。徐志微等也認(rèn)為ABA 不適于離體保存巨玫瑰、黑玫瑰葡萄組培苗[43]。同時(shí)，Renau等認(rèn)為ABA會(huì)引起雪松緩慢生長保存中的甲基化[31]。王愛華等也發(fā)現(xiàn)，在2.0 mg·L-1ABA上保存半夏出現(xiàn)了1條新增標(biāo)記和1條缺失標(biāo)記，個(gè)體變異率為30%[10]。因此，不建議在櫻桃緩慢生長保存時(shí)添加ABA，但若需要?jiǎng)?chuàng)造新資源，使用ABA進(jìn)行保存也許是一個(gè)方法。同時(shí)，本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，所有添加甘油的培養(yǎng)基上的植株均死亡，說明甘油不能用于櫻桃中期保存。