周萬(wàn)明 綜述，魯雄兵 校審

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，江西南昌 330006)

外泌體是由細(xì)胞主動(dòng)脫落釋放的直徑在40～100 nm的囊泡小體[1]，其膜由雙層磷脂分子層構(gòu)成。人體內(nèi)多種細(xì)胞都可分泌外泌體，包括血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[2]等，但不同的細(xì)胞分泌的外泌體亞型有區(qū)別。在大多數(shù)體液及細(xì)胞培養(yǎng)液中均可檢測(cè)到外泌體。最新研究表明外泌體參與細(xì)胞間通訊，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移上發(fā)揮了重要作用。

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的癌癥之一，也是西方最常見(jiàn)的八種癌癥之一,其中移形細(xì)胞癌(占90%)發(fā)病率僅次于前列腺癌。外泌體參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移，攜帶的貨物有助于疾病的診斷、分期以及預(yù)后的監(jiān)測(cè)。

1 外泌體的生化特征

外泌體的主要分泌機(jī)制有兩種：依賴高爾基體的連續(xù)分泌和誘導(dǎo)分泌。不同亞型的外泌體釋放機(jī)制可能不同，攜帶的貨物成份也不同[3]。外泌體膜上及膜內(nèi)富集了大量的蛋白,比如膜轉(zhuǎn)運(yùn)和膜融合蛋白(如GTPases、Annexins和Flotillin)、多囊泡體合成所需的蛋白質(zhì)(如腫瘤易感基因101)、四跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81)、凋亡連接基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked gene2-interacting protein X，ALIX)、熱休克蛋白(heat shock proteins，如HSP70、HSP90)[2]等。外泌體內(nèi)攜帶許多核酸分子,如miRNA、非編碼的RNA 及mRNA等[4]。另外也攜帶了來(lái)源細(xì)胞相似的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等蛋白質(zhì)。

外泌體的分離方法尚未統(tǒng)一，包括蔗糖梯度離心、差異超速離心、過(guò)濾離心、免疫親和捕獲技術(shù)、層析技術(shù)、微流控芯片技術(shù)以及PEG聚合物沉淀[2]等，這些技術(shù)適當(dāng)?shù)慕M合可能效果會(huì)更好，目前也有較多基于以上原理的商業(yè)試劑盒。黃金標(biāo)準(zhǔn)方法是差異超速離心[5]。蔗糖梯度離心法得到的外泌體純度高，但前期準(zhǔn)備耗時(shí)、提取過(guò)程非常耗時(shí)且產(chǎn)量少。外泌體短期儲(chǔ)存(1～2 d內(nèi))置于4 ℃即可，長(zhǎng)期保存則應(yīng)放置于-80 ℃[6]。

外泌體的鑒定依賴于形態(tài)學(xué)觀察和蛋白質(zhì)組成分析。在電鏡下觀察外泌體的形態(tài)，可見(jiàn)杯狀、或?yàn)楸馄角蚰殷w[7]，也可用納米顆粒追蹤(nanoparticle tracking analysis，NTA)對(duì)其直徑大小進(jìn)行測(cè)量；蛋白組成分析常用Western blot技術(shù)檢測(cè)外泌體富集的蛋白質(zhì)表達(dá)水平[8]，如常選擇檢測(cè)CD63和CD81。

2 外泌體與腫瘤

外泌體最早被發(fā)現(xiàn)參與抗原呈遞和免疫激活與抑制[9]。肥大細(xì)胞通過(guò)釋放的外泌體將其內(nèi)的mRNA、miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)翻譯出了蛋白質(zhì)，因此證明外泌體具有轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的功能。外泌體的脂質(zhì)雙層膜降低了外泌體被蛋白酶及核糖核酸酶的降解，通過(guò)自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌等分泌途徑從細(xì)胞膜上脫落下來(lái)，膜內(nèi)攜帶蛋白質(zhì)、核酸等信號(hào)分子，通過(guò)受體-配體相互作用、直接膜融合、內(nèi)吞作用(或吞噬作用)3種途徑將信號(hào)從外泌體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞[2]，參與細(xì)胞間通訊、血管新生、免疫反應(yīng)和腫瘤生長(zhǎng)等生理和病理過(guò)程[10]。外泌體參與了腫瘤微環(huán)境的組成，促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)、核酸、功能性跨膜蛋白、趨化因子受體、表皮生長(zhǎng)因子受體等來(lái)介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、腫瘤血管生長(zhǎng)、腫瘤轉(zhuǎn)移[11]、腫瘤免疫逃逸[9]、腫瘤微環(huán)境的形成[12]等。

腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放外泌體，其攜帶的信號(hào)分子特征可以反應(yīng)腫瘤細(xì)胞表型，比如腫瘤特異性抗原蛋白和RNA，它們具有很大的潛能作為腫瘤診斷的標(biāo)志物[13]。THERY 等[9]的研究表明外泌體在B淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用，同時(shí)腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌外泌體來(lái)排出抗腫瘤的藥物而導(dǎo)致腫瘤的多重耐藥性。CLAYTON等[14]的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌、前列腺癌、直腸癌等癌細(xì)胞分泌的外泌體中含有CD39和CD73，它們可以減少腺苷的產(chǎn)生和阻止T細(xì)胞的活化來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。

外泌體與腫瘤息息相關(guān)，參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、耐藥、逃避免疫監(jiān)視，同時(shí)也可以協(xié)助診斷與治療等。

3 外泌體與膀胱癌的研究

3.1 膀胱癌來(lái)源的外泌體促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移SAMANT等[15]發(fā)現(xiàn)前列腺癌、膀胱癌以及乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體含有轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，作用于受體細(xì)胞成纖維細(xì)胞，可以減少肌成纖維細(xì)胞活化、促進(jìn)腫瘤的血管再生和腫瘤生長(zhǎng)。BERNARD等[16]研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌細(xì)胞衍生的外泌體含有轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)，通過(guò)外泌體介導(dǎo)的TGF-β轉(zhuǎn)移和SMAD途徑激活觸發(fā)成纖維細(xì)胞分化成癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)。OSTENFELD等[17]的研究顯示膀胱癌細(xì)胞分泌的miRNA-23b可以使癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能。FRANZEN等[18]證明膀胱癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以在靶細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這一過(guò)程與表型的改變導(dǎo)致癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外,體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體上調(diào)Bcl-2和Cyclin-D1抑制癌細(xì)胞凋亡,激活膀胱癌細(xì)胞中的Akt和ERK通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖[19]。CARLA等[20]證實(shí)膀胱癌患者尿液來(lái)源的外泌體中含有上皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)I樣域蛋白3[epidermal Growth Factor (EGF)-Like Repeats and Discoidin I-Like Domains 3，EDIL-3 ]，EDIL-3可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成和遷移，當(dāng)實(shí)驗(yàn)沉默EDIL-3 后，其外泌體未能促進(jìn)血管生成以及尿道上皮和內(nèi)皮細(xì)胞遷移。此外，從高級(jí)別膀胱癌患者的尿中純化的外泌體中EDIL-3比健康對(duì)照組的表達(dá)水平更高，因此EDIL-3/DeL1蛋白可能可以用于評(píng)估膀胱癌的分級(jí)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)與膀胱癌疾病進(jìn)展相關(guān)，BERRONDO等[21]通過(guò)富集膀胱癌患者尿液外泌體中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR，證實(shí) HOTAIR在膀胱癌細(xì)胞系中的敲低減少了膀胱癌細(xì)胞體外遷移和侵襲力。重要的是，膀胱癌細(xì)胞系中HOTAIR表達(dá)的缺失會(huì)改變包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)基因的表達(dá)(如：SNAI1、ZEB1、ZO1、MMP1、LAMB3和LAMC2等)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與癌癥的形成密切相關(guān)。如圖1示。

圖1 膀胱癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移

a：外泌體中含TGF-β促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[15]；b：外泌體中的miR-23b促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[17]；c：癌細(xì)胞來(lái)源外泌體通過(guò)上調(diào)Bcl-2及Cyclin-D1抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)增值[19]；d：癌細(xì)胞系中長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR表達(dá)的缺失或改變會(huì)改變包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化( EMT )基因的表達(dá)[21]。

3.2 外泌體具有成為膀胱癌診斷標(biāo)志物的潛能膀胱癌臨床主要診斷和監(jiān)測(cè)工具是尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和膀胱鏡檢查，但是尿細(xì)胞學(xué)檢測(cè)敏感性欠佳，尤其是低度惡性腫瘤；膀胱鏡檢查是目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”，屬于侵入性檢查。然而，據(jù)報(bào)道使用膀胱鏡并不能全部檢出乳頭狀腫瘤(Ta和T1)以及高度的CIS病變[22]。因此臨床上急需探尋一種非侵入性且特異性和敏感性高的檢查方法。

尿液來(lái)源的外泌體越來(lái)越多地被研究，因其有以下優(yōu)點(diǎn)：可以通過(guò)非侵入性的方法從尿液中提?。荒蚵飞掀ぜ?xì)胞與尿液之間的接觸為外泌體分泌到尿液中提供了充足的條件，并且不同部位的上皮細(xì)胞分泌的外泌體，其膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子組成及含量不同，可通過(guò)外泌體膜的特征來(lái)分離膀胱來(lái)源的外泌體；外泌體是納米級(jí)顆粒，不能透過(guò)腎臟的濾過(guò)膜，所以尿液相對(duì)于血液減少了其他系統(tǒng)的干擾。這些特征使得外泌體很有可能成為腎、膀胱、尿道和前列腺等泌尿系統(tǒng)疾病診斷的潛在標(biāo)志物[23]。

膀胱癌外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，從3例膀胱移行細(xì)胞癌患者尿液中分離的外泌體，其中CD36、CD44、CD73、滋養(yǎng)層糖蛋白 (5T4)的表達(dá)與健康組有明顯的差別。PEREZ等[24]發(fā)現(xiàn)尿液來(lái)源外泌體中的RNA可以作為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物，且人源性長(zhǎng)壽保障基因2和黏液糖化蛋白酶1可以作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物。BAUMGART等[25]發(fā)現(xiàn)尿液來(lái)源的肌層浸潤(rùn)性膀胱癌外泌體與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌外泌體中miRNA表達(dá)有差異，有助于鑒別診斷，但是仍然沒(méi)有單獨(dú)的一個(gè)指標(biāo)可用于臨床[26]。未來(lái)有望發(fā)現(xiàn)更可靠的指標(biāo)盡早用于臨床。

3.3 外泌體可用于膀胱癌的治療無(wú)論如今的多學(xué)科治療如何努力，膀胱癌的高復(fù)發(fā)率仍是目前治療最大的障礙，外泌體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在癌癥進(jìn)展中的重要作用使得外泌體成為潛在的新型治療靶點(diǎn)，其重點(diǎn)集中于抑制腫瘤細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組分。外泌體有望在膀胱癌患者的治療中發(fā)揮重要作用，有助于早期診斷和監(jiān)測(cè)，也可提供準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。如圖2所示。

圖2 兩種利用外泌體治療膀胱癌的潛在策略

a：外泌體用于研制運(yùn)輸抗癌藥物的載體，利用腫瘤來(lái)源的外泌體攜帶抑制腫瘤細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移的藥物靶向輸送至腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用；b：通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體來(lái)抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[27]：抑制外泌體合成或釋放，利用抗原抗體反應(yīng)特異性去除循環(huán)中的腫瘤外泌體，阻斷腫瘤外泌體與細(xì)胞的識(shí)別。

3.3.1外泌體用于研制運(yùn)輸抗癌藥物的載體 外泌體的脂質(zhì)雙分子層膜可以保護(hù)膜內(nèi)核酸及蛋白質(zhì)不被降解，同時(shí)膜上具有識(shí)別分子，外泌體可以很好地成為靶向運(yùn)輸藥物的載體。它可精準(zhǔn)運(yùn)輸干擾RNA、自殺mRNA、蛋白質(zhì)、miRNA、藥物等。盡管外泌體具有巨大的治療潛力，但是該領(lǐng)域仍需要新的體內(nèi)模型和強(qiáng)大的成像系統(tǒng)來(lái)追蹤單個(gè)細(xì)胞外泌體的合成、釋放、運(yùn)輸和發(fā)揮作用的途徑。

3.3.2通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體來(lái)抑制腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移 外泌體參與了腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成、腫瘤細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。誘導(dǎo)或干擾外泌體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用即可抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，目前有幾種潛在策略[27]：①通過(guò)干涉參與外泌體形成的途徑組分(如ESCRT，神經(jīng)酰胺)或釋放(如Rab27、ARF6、RhoA)而抑制外泌體的生物發(fā)生或釋放；②通過(guò)體外血液濾過(guò)從循環(huán)中去除外泌體；③通過(guò)阻斷參與外泌體結(jié)合或內(nèi)化的外泌體配體(如四跨膜蛋白)或細(xì)胞表面受體(如HSPG)來(lái)抑制受體細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取。YANG等[28]的研究提示抑制膀胱癌來(lái)源的外泌體的分泌和釋放，可能為膀胱癌的治療提供新的策略。在敲低Rab27 siRNA的膀胱癌細(xì)胞，引起腫瘤抑制劑miR-23b在外泌體中表達(dá)降低，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增加，減弱細(xì)胞侵襲性，該效應(yīng)被miR-23b抑制逆轉(zhuǎn)。MARLEAU等[29]的研究顯示在人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者中，使用抗HER-2抗體從循環(huán)中去除表達(dá)HER-2的外泌體可以改善乳腺癌的治療結(jié)果。FRANZEN等[30]的研究證實(shí)了在SW780膀胱癌細(xì)胞通過(guò)硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)受體介導(dǎo)內(nèi)吞膀胱癌來(lái)源的外泌體，用肝素可部分抑制內(nèi)吞作用的發(fā)生。HSPGs介導(dǎo)的這種攝取途徑似乎對(duì)外泌體的功能很重要，用肝素競(jìng)爭(zhēng)性抑制靶細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取，顯著抑制外泌體誘導(dǎo)的靶細(xì)胞遷移[31]。以上三項(xiàng)研究證明利用幾種潛在策略干擾外泌體來(lái)治療癌癥是可行的。

4 展 望

越來(lái)越多的研究顯示外泌體在生理及病理過(guò)程中扮演著非常重要的角色。希望未來(lái)能夠統(tǒng)一外泌體分離與表征的方法，有望從血液或尿液來(lái)源的外泌體中找到膀胱癌的診斷標(biāo)志物和監(jiān)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞釋放和分泌外泌體的機(jī)制以及影響膀胱癌發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制還需進(jìn)一步闡明，從而找到精準(zhǔn)的抑制外泌體在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的促進(jìn)作用，卻不影響正常細(xì)胞功能的治療方法。