黃滟添 鐘衛(wèi)一 梁志海 唐國都

【摘 要】目的：觀察在大鼠急性壞死性胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）時脊髓組織中硫氧還蛋白-2（thioredoxin-2，Trx-2）的表達(dá)，探討褪黑素對Trx-2表達(dá)的影響與對脊髓保護(hù)作用的關(guān)系。方法：72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為ANP組（A組）、褪黑素干預(yù)組（M組）、對照組（C組），每組24只.A組、M組腹腔注射6%左旋精氨基酸25mL/kg體質(zhì)量3次，誘發(fā)ANP;M組在首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射0.25%褪黑素20mL/kg體質(zhì)量，而A組首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射生理鹽水20mL/kg體質(zhì)量;C組同法注射等量生理鹽水.各組大鼠在末次腹腔注射后6、12、24h處死。光鏡下觀察胰腺和脊髓病理改變。免疫組織化學(xué)和RT-PCR分別檢測脊髓組織Trx-2和Trx-2mRNA的表達(dá)，并檢測脊髓組織中丙二醛（malondialdehyde;MDA）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase;MPO）含量。結(jié)果：A組各時點(diǎn)胰腺病理評分顯著高于C組和M組;M組脊髓組織MDA、MPO的含量在12、24h時點(diǎn)較A組顯著降低（P均<0.05）;A組脊髓組織Trx-2和Trx-2mRNA的表達(dá)量在24h時點(diǎn)均較C組和M組顯著增多（P均<0.05）。結(jié)論：脊髓組織Trx-2在ANP晚期的表達(dá)顯著升高;褪黑素干預(yù)可減輕脊髓組織的損傷，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)而降低Trx-2的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】硫氧還蛋白-2;脊髓組織;褪黑素;急性壞死性胰腺炎

【中圖分類號】R63.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-597X（2019）19-0104-02

急性壞死性胰腺炎（acutenecrotizingpancreatitis，ANP）可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)。Trx-2是存在于細(xì)胞線粒體一種氧化還原蛋白，Trx-2在防止線粒體氧化應(yīng)激方面具有重要作用[1，2]。本文通過應(yīng)用外源性褪黑素干預(yù)ANP大鼠，觀察脊髓組織Trx-2和Trx-2mRNA的表達(dá)及脊髓組織病理、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，探討Trx-2在ANP的表達(dá)與及褪黑索對脊髓組織保護(hù)作用的機(jī)制。

1.材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠72只，清潔級，體質(zhì)量200～250g（由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）;左旋精氨基酸（Sigma公司）;褪黑素（Sigma公司）;RNAsimpleTolalRNAKit（Tiangen公司）;RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas公司）;SYBRPremixExTaqTM（TaKaRa公司）.兔抗鼠多抗（北京生物合成及生物技術(shù)公司）

1.2方法

1.2.1 分組及造模

72只大鼠按隨機(jī)表法分成ANP組（A組）、褪黑素組（M組）和對照組（C組），每組24只.模型建立：各組大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h.自由飲水;A組和M組腹腔注射6%左旋精氨基酸25mL/kg體質(zhì)量3次，誘發(fā)ANP;M組在首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射0.25%褪黑素20mL/kg體質(zhì)量，而A組首次注射左旋精氨基酸前0.5h腹腔注射生理鹽水20mL/kg體質(zhì)量;C組則腹腔注射等容積生理鹽水。末次腹腔注射后6、12、24h按時點(diǎn)處死大鼠.留取動脈血，胰腺和頸段脊髓組織標(biāo)本.

1.2.2 胰腺和脊髓病理學(xué)檢查

胰腺和脊髓組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片及HE染色.光鏡下觀察大鼠胰腺和脊髓病理，胰腺病理參考Kusske等[3]的標(biāo)準(zhǔn)評分.

1.2.3 脊髓組織MDA、MPO和血清MDA的測定

制備脊髓組織勻漿和血清標(biāo)本，采用微量MDA試劑盒和MPO試劑盒（南京建成生物工程研究所），操作按說明書。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測脊髓組織Trx-2表達(dá)

采用Elivison二步法檢測脊髓組織Trx-2表達(dá)。兔抗鼠多抗工作濃度1：200;生物素化羊抗兔二抗來自即用型免疫組化Elivisionplus廣譜試劑盒。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知表達(dá)Trx-2的乳腺癌組織作為陽性對照。應(yīng)用Leica圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量灰度掃描，求出給定面積內(nèi)的灰度值。

1.2.5 RT-PCR檢測脊髓組織Trx-2mRNA的表達(dá)

取脊髓組織各約50mg，用RNAsimpleTolalRNAKit提取總RNA，以RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBRPremixExTaqTM熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增目的片段.據(jù)GenBank中的基因序列自行設(shè)計(jì)引物，Trx-2mRNA引物，Sense：5'TGGGCTTCCCTCACCTCTAC3'，Anti-Sense：5'GCTGTTTGGCTACCATCTTC3'，產(chǎn)物長度253bp;β-actin引物，Sense：5'CCCATCTATGAGGGTTACGC3'，Anti-Sense：5'TTTAATGTCACGCACGATTTC3'，產(chǎn)物長度150bp.反應(yīng)條件為：94℃30s;94℃30s，56℃30s，72℃30s，40個循環(huán);最后72℃2min最后融解曲線分析從56℃起，每增0.5℃進(jìn)行讀板，直到94℃.每次擴(kuò)增設(shè)無cDNA的陰性對照.在I-CyclerIQ型實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）上擴(kuò)增并分析結(jié)果（樣品的Trx-2mRNA表達(dá)值=Trx-2mRNA起始拷貝數(shù)/β-actin起始拷貝數(shù)）.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 胰腺組織病理分值（表1）

2.2 脊髓組織病理

C組脊髓大體未見明顯異常，光鏡下脊髓神經(jīng)元胞體豐滿，與周圍組織連接緊密，胞膜無皺縮，細(xì)胞漿、細(xì)胞核染色正常.A組脊髓大體見輕度腫脹，光鏡下部分脊髓神經(jīng)元胞體脹大，細(xì)胞均質(zhì)濃染，脊髓組織少數(shù)區(qū)域溶解，形成空白區(qū)，炎細(xì)胞侵潤明顯，24時點(diǎn)明顯。M組大體改變同C組，鏡下脊髓組織損傷輕，僅部分神經(jīng)元神經(jīng)元胞體稍脹大，少量炎細(xì)胞侵潤。

2.3大鼠脊髓組織MDA、MPO和血清MDA、Trx-2等各項(xiàng)指標(biāo)的變化（表1）。

3.討論

Trx是一個廣泛分布的氧化還原蛋白，通過其活性中心可逆地催化許多氧化還原反應(yīng)，參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)的Trx有多種，最為重要的是Trx-1和Trx-2。Trx-1是一種內(nèi)生抗氧化物，在胞質(zhì)通過直接清除活性氧而發(fā)揮抗氧化作用，在胞核通過抑制ikB-α的磷酸化，遏制NF-kB的活化，減少致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮間接抗炎、抗氧化作用[5]。Ritz等[6]認(rèn)為，Trx-2可相當(dāng)于Trx-1，在氧化應(yīng)激條件下，可以作為一個備份系統(tǒng)。最近研究揭示，線粒體在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Trx-2在參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑和防止線粒體氧化應(yīng)激方面，比Trx-1更具重要作用[2]。

褪黑素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對氧化應(yīng)激的器官具有保護(hù)作用。褪黑素分子能跨越任何形態(tài)的屏障進(jìn)入任何細(xì)胞而不受特定細(xì)胞間的分布限制。褪黑素能減輕多種物質(zhì)誘導(dǎo)的多種組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺組織的Trx-2mRNA的表達(dá)較對照組顯著增高，外源性給予褪黑素干預(yù)可胰腺和脊髓組織提高胰腺組織的抗氧化能力，減輕胰腺和脊髓組織的損傷，Trx-2在氧化應(yīng)激條件下，作為一個備份系統(tǒng)，Trx-2mRNA的表達(dá)水平因此而降低。

參考文獻(xiàn)

[1]MiryoungSong，Ju-SimKim，LinLiu，etal.Thioredoxin-2 InhibitsMitochondrialROSGenerationandASK1ActivitytoMaintainCardiacFunction[J].Circulation2015，131（12）：1082-1097.

[2]SuganoE，MurayamaN，TakahashiM，etal.EssentialRoleofThioredoxin-2inMitigatingOxidativeStressinRetinalEpithelialCells[J].JOphthalmol2013，2013（2）：185.

[3]KusskeAM，RongioneAJ，AshleySW，etal.Interleukin-10preventsdeathinlethalnecrotizing Pancreatitisinmice[J].Surgery1996，120（3）：284-288.

[4]Eva-mariaH，JoséR，CarstenB，etal.Thioredoxins，Glutaredoxins，andPeroxiredoxins—MolecularMechanismsandHealthSignificance：fromCofactorstoAntioxidantstoRedoxSignaling[J].AntioxidRedoxSignal，2013，19（13）：1539-1605.

[5]RitzD1，PatelH，DoanB，etal.Thioredoxin2isinvolvedintheoxidativestressresponseinEscherichiacoli[J].JBiolChem2000，275（4）：2505-2512.

[6]Gu-JiunLin，Shing-HwaHuang，Shyi-JouChen，etal.ModulationbyMelatoninofthePathogenesisofInflammatoryAutoimmuneDiseases[J].IntJMolSci2013，14（6）：11742-11766.

通訊作者：鐘衛(wèi)一，主任醫(yī)師，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬民族醫(yī)院消化內(nèi)科.