(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)(工程)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

太子參為石竹科植物孩兒參(Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Paxet Hoffm.)又名童參、四葉參、米參等。味甘、苦，性平，具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺之功效[1]。隨著保健食品及化妝品的進(jìn)一步開發(fā)利用[2]，市場(chǎng)對(duì)太子參的需求日益增加。由于太子參特有的藥用價(jià)值，一方面人們大量挖采野生太子參，導(dǎo)致太子參野生資源大量減少；另一方面，人們大量種植太子參，種植面積逐年擴(kuò)大，由于連作導(dǎo)致其體內(nèi)積累病毒，使其種性下降，嚴(yán)重影響產(chǎn)量及品質(zhì)[3]。因此培育豐富的太子參育種材料非常必要。

EMS是一種操作簡(jiǎn)單、突變頻率高、特異性強(qiáng)的典型化學(xué)誘變劑[4]。目前，已有學(xué)者應(yīng)用EMS溶液處理不同作物的種子，并獲得了相應(yīng)作物的突變體，利用形態(tài)分析構(gòu)建了包括大豆、菊花、小麥、水稻等在內(nèi)的眾多植物的突變體庫(kù)[5-8]。而用EMS誘導(dǎo)太子參種子鮮見報(bào)道。用EMS作為誘變劑時(shí)，一般用EMS半致死劑量處理材料能達(dá)到較好的誘變效果[4]，因此找到EMS半致死劑量是誘變的關(guān)鍵點(diǎn)。本研究采用不同濃度EMS處理太子參種子，分析不同濃度對(duì)種子萌發(fā)特性、種子電導(dǎo)率、相關(guān)酶活性的影響，進(jìn)行綜合分析以確定EMS處理太子參種子的半致死劑量，旨為EMS誘變太子參種子提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

太子參種子，在貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)(工程)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用低溫砂藏方法解除太子參種子休眠[9]。

1.2 方 法

1.2.1試驗(yàn)處理方法

1)EMS誘變劑采用pH值為7.0磷酸緩沖液配制而成[10]，配制的濃度分別為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。挑選已解除休眠的飽滿太子參種子1 000粒，用自來水沖洗2 h后，用不同濃度EMS浸種，80 r·min-1高速震蕩12 h后，每處理加入1 moL·L-1硫代硫酸鈉10 mL，搖勻并將溶液倒掉；然后用100 mmoL·L-1硫代硫酸鈉洗3遍，再用自來水清洗3遍。分別取各處理的太子參種子，每處理50粒，重復(fù)5次，分別測(cè)定其浸出液電導(dǎo)率、SOD、POD活性及 MDA含量。

2)取各處理的太子參種子進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)，每處理50粒，重復(fù)6次。將種子轉(zhuǎn)至鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱，溫度10 ℃、光照8 h、黑暗16 h條件下培養(yǎng)[12]。每天觀察、清除霉變或感菌的種子、補(bǔ)充水份、培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率、幼苗生長(zhǎng)情況，從每個(gè)處理每個(gè)重復(fù)取10株幼苗測(cè)量株高、10株重量，并測(cè)定各處理幼苗的SOD、POD活性及MDA含量。

1.2.2測(cè)定指標(biāo)方法

1)太子參種子浸出液電導(dǎo)率采用DDS-307型電導(dǎo)儀進(jìn)行測(cè)定，以靜止0.5 h的蒸餾水作空白對(duì)照[11]。

電導(dǎo)率(%)=(處理電導(dǎo)率平均值-蒸餾水電導(dǎo)率值)/50粒種子重量平均值×100%。

2)太子參種子萌發(fā)率的計(jì)算。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

相對(duì)發(fā)芽率(%)=(處理的發(fā)芽率/對(duì)照發(fā)芽率)×100%；

3)相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定方法。

SOD 活性測(cè)定采用 FridorichNBT 光還原法[13]，POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[14]，MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 DPS 7.05 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Excel 2010軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)太子參浸出液電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，隨著EMS濃度增大，太子參種子浸出液電導(dǎo)率也隨之增大。說明EMS對(duì)太子參種子細(xì)胞質(zhì)膜有傷害作用，且EMS濃度越大細(xì)胞質(zhì)膜受傷害越嚴(yán)重。研究表明，種子浸出液電導(dǎo)率小于24μS·(cm·g)-1種子活力強(qiáng)，25～29μS·(cm·g)-1種子活力尚佳，30～40μS·(cm·g)-1種子活力較差，大于40μS·(cm·g)-1種子活力很差[11]。從圖1可以看出，當(dāng)EMS濃度在0.4%以下時(shí)太子參種子活力仍較強(qiáng)，EMS濃度在0.6%～0.8%時(shí)太子參種子活力較差，當(dāng)EMS濃度達(dá)到1.0%時(shí)其種子活力很差，基本失去種用價(jià)值。

圖1 不同濃度EMS處理對(duì)太子參種子電導(dǎo)率的影響

2.2 EMS處理對(duì)太子參種子萌發(fā)的影響

從表1可知，EMS對(duì)太子參種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)具有抑制作用。隨著EMS濃度增加，太子參種子發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率越低，各處理間差異極顯著；幼苗株高與幼苗重總體呈下降趨勢(shì)，0.0%與0.2%處理間幼苗高與幼苗重差異不顯著，與0.4%～1.0%差異顯著。在以EMS作誘導(dǎo)劑時(shí)，通常以半致死劑量為適宜處理。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EMS濃度為0.0%時(shí)，太子參種子發(fā)芽率為84.5%、相對(duì)發(fā)芽率為100%，所以太子參種子以相對(duì)發(fā)芽率為50% 時(shí)的EMS劑量作為處理比較適宜，因此處理太子參種子的EMS適宜濃度為0.6%～0.8%。

表1 不同濃度EMS處理對(duì)太子參種子萌發(fā)及幼苗發(fā)育特性的影響

注：不同小寫字母表示在 5% 水平差異顯著，不同大寫字母表示在1%水平差異極顯著。下同。

2.3 EMS處理對(duì)太子參種子及幼苗SOD、POD活性的影響

由圖2、圖3可知，不同EMS濃度處理對(duì)太子參種子及幼苗的SOD、POD活性都有影響。種子及幼苗SOD、POD的活性隨著EMS濃度的增加都有先增加后減小的趨勢(shì)。在EMS濃度為0～0.4%時(shí)，SOD活性增加比較平緩，在0.4%～0.8%時(shí)，SOD活性增加比較快，在EMS濃度為0.8%時(shí)種子及幼苗的SOD活性都達(dá)到最大，且差異顯著，之后隨著EMS濃度的增加SOD活性呈下降趨勢(shì)。種子及幼苗POD活性隨EMS濃度的變化有一定區(qū)別，種子的POD活性，在EMS濃度為0.6%時(shí)達(dá)到最大，之后隨濃度增加而減弱。而幼苗的POD活性，在EMS濃度為0.8%時(shí)達(dá)到最大，之后隨濃度的增加而減弱。不同EMS濃度處理，太子參種子的SOD、POD活性都比幼苗的高。相關(guān)研究表明，植物的抗性與SOD、POD活性成正相關(guān)關(guān)系[16]。因此EMS濃度為0.6%～0.8%時(shí)，適宜太子參種子的誘導(dǎo)。

2.4 EMS處理對(duì)太子參種子及幼苗MDA含量的影響

由圖4可知，不同濃度處理對(duì)太子參種子及幼苗的MDA含量都有影響，但對(duì)種子的影響較大。隨著EMS濃度的增加種子及幼苗的MDA含量都隨之增加，且差異顯著，種子MDA含量變化大，為4.9～21μmol·g-1，而幼苗MDA含量變化平緩，為0.7～2.1μmol·g-1，且經(jīng)EMS處理后太子參種子的MDA含量都明顯高于幼苗的。

圖2 不同濃度EMS處理對(duì)太子參種子及幼苗SOD活性的影響

圖3 不同濃度EMS處理對(duì)太子參種子及幼苗POD活性的影響

圖4 不同濃度EMS處理對(duì)太子參種子及幼苗MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

種子浸出液電導(dǎo)率是測(cè)定種子活力的重要指標(biāo)之一。不同濃度EMS處理對(duì)種子細(xì)胞膜損傷的不同，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏的多少不同，使種子浸出液電導(dǎo)率不同，而且相同處理時(shí)間，EMS濃度越大對(duì)種子細(xì)胞膜損傷越大，其浸出液電導(dǎo)率越大。通過測(cè)定種子浸出液電導(dǎo)率，初步確定種子受到一定程度損傷，但損傷程度不大的EMS濃度。本試驗(yàn)表明，隨著EMS濃度的增加，太子參種子浸出液電導(dǎo)率逐漸增大，在濃度為0.6%～0.8%時(shí)，其電導(dǎo)率為28.55～32.54μS·(cm·g)-1是適宜的濃度。

高秀華等[16]用不同濃度EMS處理鹽芥種子，發(fā)現(xiàn)隨著EMS濃度增加M 1發(fā)芽率逐漸降低；原小燕等[17]用EMS處理油菜種子，發(fā)現(xiàn)隨著EMS濃度增加，種子幼苗生長(zhǎng)發(fā)育受到的抑制越大。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度EMS處理太子參種子，然后測(cè)定其種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率，以及幼苗高、10株幼苗的重量，得出隨著EMS濃度的增加，太子參種子發(fā)芽率與相對(duì)發(fā)芽率隨之下降，幼苗高、幼苗重量也隨之降低，與其他學(xué)者研究結(jié)論相同。

EMS作為誘導(dǎo)劑時(shí)，通常把誘變處理半致死劑量作為選擇依據(jù)[19]。由于太子參種子在適宜條件下發(fā)芽率是85.6%，所以本試驗(yàn)是以太子參種子萌發(fā)的相對(duì)發(fā)芽率來確定其半致死劑量，EMS濃度為0.6%～0.8%時(shí)，太子參種子的相對(duì)萌發(fā)率為60%～45.5%，所以EMS濃度為0.6%～0.8%是太子參種子半致死劑量。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著EMS濃度的增加，太子參種子及幼苗的SOD、POD活性呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，MDA的含量呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。一方面EMS處理誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基等有害大分子，而 SOD、POD 作為保護(hù)性酶可有效地清除這些有害物質(zhì)，因此SOD、POD活性在一定濃度范圍內(nèi)會(huì)增加，當(dāng)EMS濃度過大，會(huì)造成種子、幼苗的一些細(xì)胞失活，又會(huì)使SOD、POD活性下降。此外，在不同EMS濃度下，太子參種子SOD、POD活性和MDA含量都高于幼苗的?？赡苁怯捎诜N子發(fā)育成幼苗的過程中機(jī)體會(huì)代謝掉由EMS作用產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，導(dǎo)致其對(duì)幼苗的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及種子。