白宇清 王定躍 謝利娟

（1深圳市梧桐山風(fēng)景區(qū)管理處，廣東深圳 518004；2深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055）

杜鵑花是世界4大著名花卉之一，也是我國(guó)10大傳統(tǒng)名花之一［1］。其中，毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense Hook.f.）是分布最南的高山杜鵑，為杜鵑花科常綠小喬木，高3～8m，花期3—4月，盛花時(shí)粉色花朵覆蓋整個(gè)樹(shù)冠，觀(guān)賞價(jià)值極高。毛棉杜鵑的大部分植株自然分布在梧桐山400～700m的較高海拔區(qū)域，而在深圳市區(qū)低海拔地帶未見(jiàn)分布。目前，主要采取將梧桐山的毛棉杜鵑與山下低海拔地區(qū)適應(yīng)性強(qiáng)的杜鵑雜交，以實(shí)現(xiàn)將毛棉杜鵑引種到低海拔地區(qū)的目的。為了便于毛棉杜鵑雜交育種的順利開(kāi)展，對(duì)毛棉杜鵑花粉活力的研究必不可少。

目前，杜鵑花粉常采用醋酸洋紅、TTC以及MTT染色法測(cè)定其活力［2-3］，其中，MTT染色法與花粉體內(nèi)萌發(fā)率最為接近［4］。Brewbaker-Kwack培養(yǎng)基用于測(cè)定杜鵑花的花粉活力［5］，該培養(yǎng)基也適用于其他植物花粉培養(yǎng)。國(guó)內(nèi)外對(duì)杜鵑花花粉活力的測(cè)定方法及離體萌發(fā)培養(yǎng)基配方的研究仍較少，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)有卜志國(guó)等［6］對(duì)映山紅開(kāi)花習(xí)性與花粉生活力的研究。為此，筆者以毛棉杜鵑花粉為試驗(yàn)材料，利用蔗糖、H3BO3、CaCl2單因素及正交試驗(yàn)篩選毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，同時(shí)找出快速且適宜的毛棉杜鵑花粉活力測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料毛棉杜鵑花粉采自深圳梧桐山風(fēng)景區(qū)小梧桐停車(chē)場(chǎng)周邊的野生毛棉杜鵑植株?；ǚ鄄杉髱Щ貙?shí)驗(yàn)室充分混合并自然干燥約24～36h，置于-20℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法在雙孔的凹型載玻片孔內(nèi)滴入0.1mL的培養(yǎng)液，用牙簽或針將花粉均勻點(diǎn)入培養(yǎng)液中，將載玻片放入保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)于25℃人工氣候箱中，光照培養(yǎng)8h后在顯微鏡下觀(guān)察統(tǒng)計(jì)?；ǚ酃荛L(zhǎng)度大于或等于花粉粒直徑、四合體有一個(gè)萌發(fā)的花粉即視為已萌發(fā)，每處理統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野，每個(gè)視野花粉不少于50粒，3個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)處理

1.3.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2單因子試驗(yàn) 以毛棉杜鵑花粉為試驗(yàn)材料，蔗糖的質(zhì)量濃度梯度為0、50、100、150、200、300g·L-1；H3BO3的質(zhì)量梯度濃度為0、50、100、200、300、500mg·L-1；CaCl2的質(zhì)量濃度梯度為0、50、100、200、300、500mg·L-1的培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。

1.3.2 蔗糖、H3BO3、CaCl2正交試驗(yàn) 在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（33）的正交試驗(yàn)。

1.3.3 染色法測(cè)定杜鵑花花粉活力 以毛棉杜鵑花粉為測(cè)定花粉活力，采用TTC、I2-KI、醋酸洋紅染色法測(cè)定花粉活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2單因子試驗(yàn)

2.1.1 蔗糖 適當(dāng)濃度的蔗糖能促進(jìn)花粉管的萌發(fā)，因?yàn)檫m當(dāng)濃度的蔗糖能維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡，蔗糖濃度過(guò)高導(dǎo)致花粉管破裂，產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，造成原生質(zhì)體脫水，花粉不萌發(fā)［7］。由表1可知，蔗糖對(duì)毛棉杜鵑花粉管萌發(fā)的影響呈先增加后減小的變化趨勢(shì)，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的蔗糖最佳濃度為50～200g·L-1。

表1 蔗糖對(duì)毛棉杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

2.1.2 H3BO3H3BO3在植物體花中含量最高，其中柱頭和子房的含量最高。H3BO3通過(guò)增加糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，促進(jìn)構(gòu)成果膠物的合成，即促進(jìn)花粉管壁的形成。一般花粉中的硼酸含量不足，需從柱頭和花柱中轉(zhuǎn)運(yùn)補(bǔ)償，因此在花粉離體培養(yǎng)中要添加一定量的硼酸［8］。由表2可知，H3BO3對(duì)毛棉杜鵑花粉管萌發(fā)的影響呈逐漸增加后減小的變化趨勢(shì)，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的H3BO3的最佳濃度為50mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1。

表2 H3BO3對(duì)毛棉杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

2.1.3 CaCl2CaCl2是花粉萌發(fā)所需的物質(zhì)，外源Ca2+的需求取決于花粉細(xì)胞內(nèi)游離鈣的含量。若內(nèi)源鈣充足，外源Ca2+會(huì)造成過(guò)高的細(xì)胞膨壓、細(xì)胞中毒抑制花粉的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)［7-8］。由表3可知，CaCl2對(duì)毛棉杜鵑花粉管萌發(fā)的影響呈逐漸增加的趨勢(shì)，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的CaCl2最佳濃度為200mg·L-1、300mg·L-1、500mg·L-1。

表3 CaCl2對(duì)毛棉杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

2.2 蔗糖、H3BO3和CaCl2三因子正交試驗(yàn)在單因子的基礎(chǔ)上，確立蔗糖、H3BO3、CaCl2的濃度范圍及各濃度梯度，進(jìn)一步進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，尋求最佳的培養(yǎng)基配方。由表4可知，毛棉杜鵑花粉在蔗糖200g·L-1、H3BO3100mg·L-1、CaCl2300mg·L-1時(shí)萌發(fā)率最高。

表4 毛棉杜鵑花花粉正交試驗(yàn)的萌發(fā)率

2.3 染色法測(cè)定杜鵑花花粉活力從各種染色劑對(duì)毛棉杜鵑花花粉的染色效果（圖1）可以看出，TTC染色法測(cè)定毛棉杜鵑花花粉活力的效果并不明顯，無(wú)法使花粉著色，即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的染色也無(wú)法明確區(qū)分出是否具有活力，故不能作為測(cè)定毛棉杜鵑花花粉活力快速有效的染色劑；I2-KI染色法顏色差異不顯著，無(wú)法區(qū)分花粉是否具有活力；醋酸洋紅染色法能夠在短時(shí)間內(nèi)使花粉著色，且染色效果明顯，容易區(qū)分，是一種較好的毛棉杜鵑花粉活力測(cè)定方法，具有簡(jiǎn)單、快捷的優(yōu)點(diǎn)。

圖1 各染色劑對(duì)毛棉杜鵑花花粉的染色效果

3 小結(jié)與討論

蔗糖是植物花粉萌發(fā)所必需的成分，能為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)維持外界環(huán)境的滲透壓［9］。蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)的影響，因植物種類(lèi)和濃度而不同。本試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）毛棉杜鵑花粉率萌發(fā)隨著花粉濃度的增加而提高，當(dāng)蔗糖濃度為200g·L-1時(shí)，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)率最高：（2）當(dāng)硼的濃度為100、200mg·L-1時(shí)，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)率最高，當(dāng)大于200mg·L-1花粉萌發(fā)率逐漸下降：（3）毛棉杜鵑花粉隨CaCl2濃度的增加而持續(xù)增加，說(shuō)明毛棉杜鵑花粉需要高濃度的CaCl2來(lái)促進(jìn)萌發(fā)。通過(guò)正交試驗(yàn)得出，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為蔗糖200g·L-1+H3BO3100mg·L-1+CaCl2300mg·L-1。

卜志國(guó)等［6］研究表明，映山紅的最佳蔗糖濃度為5%，而本研究中液體培養(yǎng)基適宜的蔗糖濃度與之有所不同。姚成義等［10］對(duì)藍(lán)豬耳花粉萌發(fā)的研究及關(guān)軍鋒等［11］對(duì)蘋(píng)果花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的研究表明，花粉萌發(fā)時(shí)不需要外源的存在。本研究中，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)結(jié)果與他們的研究結(jié)果不一致，這是由于不同植物、不同品種的花粉萌發(fā)的條件不同。

染色劑染色測(cè)定花粉活力，是一種快速、簡(jiǎn)單、快捷的方法。本試驗(yàn)得出，對(duì)于毛棉杜鵑來(lái)說(shuō)，醋酸洋紅染色法法能夠在短時(shí)間內(nèi)使花粉著色，且染色效果明顯、容易區(qū)分，對(duì)毛棉杜鵑花粉活力的測(cè)定較準(zhǔn)確。而TTC染色法和I2-KI染色法則不太適合毛棉杜鵑花花粉活力的測(cè)定。