陳淑萍， 孫玉英， 談 勇*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210023；2.常州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州213000）

卵巢儲(chǔ)備功能下降是指卵巢內(nèi)所剩卵母細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量、潛能下降，導(dǎo)致女性生育力下降，性激素缺乏，常指雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)＜6 個(gè)，抗苗勒管激素（AMH） 值低于0.5～1.1 ng／mL［1］。治療方法以激素補(bǔ)充治療（HRT）為主，但長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用后會(huì)增加卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［2-5］，患者依從性差；對(duì)有生育要求而采用體外受精-胚胎移植（IVF-ET） 的患者，也存在著周期取消率高、獲卵率及優(yōu)胚率低等問(wèn)題，從而導(dǎo)致不良結(jié)局。

坤泰膠囊為仲景名方“黃連阿膠湯” 化裁而來(lái)，由熟地黃、黃連、白芍、阿膠、黃芩、茯苓組成，具有滋陰清熱、安神除煩、交通心腎的作用，在婦科疾病中應(yīng)用廣泛，對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降的療效尤佳［6-8］。本實(shí)驗(yàn)旨在基于TGF-β／smads 信號(hào)通路觀察坤泰膠囊對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降大鼠卵巢組織smad2／3／7 分子表達(dá)的影響，以期探索其相關(guān)分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 8 周齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠65 只，體質(zhì)量（210±10） g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（浙） 2014-0001， 自由飲水和攝食， 室溫 （22±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜各12 h。

1.2 試劑 雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司，50 mg／片，批號(hào)Z33020422）。坤泰膠囊（貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司，0.5 g／粒，批號(hào)Z20000083）；戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂(lè)） （拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，1 mg／片，批號(hào)J20130009）；黃體酮膠囊（安琪坦） （浙江仙琚制藥股份有限公司，0.1 g／片，批號(hào)H20041902）。

1.3 儀器 CX21 型高分辨顯微鏡（日本Olympus 公司）；ABI7500 型Real-time PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；Mastercycler nexus PCR 儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；垂直電泳槽、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；TS-1000 型脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司）；TS-12F 型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；BMJ-M 型病理組織包埋機(jī)和包埋冷凍臺(tái)（天津天利航空機(jī)電有限公司）；EnSpire 2300 型酶標(biāo)儀（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 65 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d，期間進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片觀察，確認(rèn)所有大鼠動(dòng)情周期變化規(guī)律，隨機(jī)分為正常組10 只、模型組55 只。參照高慧等［9-11］方法，將雷公藤多苷片以生理鹽水配成50 mg／kg 劑量，每日上午9 點(diǎn)開(kāi)始連續(xù)灌胃14 d，正常組大鼠同時(shí)予等體積生理鹽水。造模第8 天起，進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片，觀察大鼠動(dòng)情周期變化，剔除造模失敗者后隨機(jī)分為模型組、西藥組各11 只，以及坤泰膠囊組、中西藥組各12 只。西藥組對(duì)處于動(dòng)情前期的大鼠先給予戊酸雌二醇片（0.12 mg／kg）2 d，再給予黃體酮膠囊（18 mg／kg） 2 d，對(duì)處于動(dòng)情后期的大鼠給藥順序恰好相反；坤泰膠囊組灌胃給藥劑量0.5 g／kg；中西藥組在坤泰膠囊基礎(chǔ)上加用上述2 種西藥；正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。給藥期間，各組大鼠按體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，連續(xù)給藥3 個(gè)動(dòng)情周期。

2.2 取材 藥物干預(yù)結(jié)束后15 d（保證所有大鼠處于動(dòng)情前期） 大鼠禁食不禁水，第2 天水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，無(wú)菌下迅速取出卵巢組織，稱定質(zhì)量，一半置于-80 ℃冰箱中待測(cè)，另一半置于4%多聚甲醛中待測(cè)。

2.2.1 HE 染色 將置于4%多聚甲醛中的大鼠卵巢組織用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢變化。

2.2.2 血清E2、LH、FSH、AMH 水平檢測(cè) 大鼠血液靜置30 min 后離心， 取上清液， ELISA 法檢測(cè)E2、 LH、FSH、AMH 水平。

2.2.3 大鼠卵巢組織Smad2／3／7 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。 蛋白定量變性后SDS-PAGE 凝膠電泳1.2 h，半干轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃搖床過(guò)夜（β-actin 為1 ∶2 000、Smad2／3 為1 ∶2 000、Smad7 為1 ∶1 000），二抗（1 ∶2 000） 室溫下孵育2 h，曝光，Image J軟件測(cè)定目的條帶OD 值，以β-actin 為內(nèi)參，將目的條帶、β-actin OD 值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.2.4 大鼠卵巢組織Smad2／3／7 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR 法。Trizol 提取RNA 后測(cè)定其濃度，按50 μL 反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。條件為cDNA 2 μL，引物濃度0.3 μmol／L；反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性，95 ℃30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin 為內(nèi)參，2-△△Ct法分析mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD 和SNK-q 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型評(píng)價(jià) 給予雷公藤多苷片的55 只大鼠呈現(xiàn)不同程度的動(dòng)情周期紊亂，表現(xiàn)為延長(zhǎng)與停滯。連續(xù)灌胃2 周后，46 只大鼠出現(xiàn)連續(xù)動(dòng)情周期紊亂，造模成功率為83.6%；2 周治療結(jié)束后，陰道脫落細(xì)胞涂片顯示28 只大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)（28／46，60.9%），其中模型組3 只（3／11，27.3%），西藥組8 只（8／11，72.7%），坤泰膠囊組8只（8／12，66.7%），中西藥組9 只（9／12，75%）。

3.2 血清性激素水平 表2 顯示，與正常組比較，模型組血清AMH、E2 水平顯著降低，LH、FSH 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，坤泰膠囊組、中西藥組、西藥組AMH、E2 水平顯著升高（P＜0.05），中西藥組、西藥組FSH、LH 水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組血清性激素水平比較n＝10）

表2 各組血清性激素水平比較n＝10）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 AMH／（ng·L-1） E2／（pg·mL-1） FSH／（U·L-1） LH／（U·L-1）正模坤中西常型泰西藥組組膠藥組 囊組 組 11111 60554.....17958 95928±±±±±21111.....54978 17207 △*** 63565 49509.....46403 14629±±±±±36474.....25915 61112 △*** 11111 06423.....00221 59931±±±±±11121.....98513 99269 △** 22222 16534.....66854 34174±±±±±21111.....36481 15976*△**

3.3 大鼠卵巢組織形態(tài) 圖1 顯示，與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織萎縮明顯，HE 染色可見(jiàn)各級(jí)卵泡減少，卵泡結(jié)構(gòu)破壞，黃體少且發(fā)育欠佳；與模型組比較，藥物干預(yù)后大鼠上述情況改善，可見(jiàn)竇卵泡、原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡，以及卵細(xì)胞、卵丘、透明帶、放射冠結(jié)構(gòu)，卵泡外圍包繞的顆粒細(xì)胞層數(shù)、黃體數(shù)量增多，排列規(guī)則，發(fā)育尚可。

圖1 各組大鼠卵巢組織變化（HE 染色，×40）

3.4 Smad2／3／7 mRNA 表達(dá) 表3 顯示，與正常組比較，模型組Smad2／3 mRNA 表達(dá)顯著降低，Smad7 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，坤泰膠囊組、中西藥組、西藥組前者mRNA 表達(dá)顯著升高，后者mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組Smad2／3／7 mRNA 表達(dá)的比較n＝10）

表3 各組Smad2／3／7 mRNA 表達(dá)的比較n＝10）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 Smad2 Smad3 Smad7正常組 1.33±0.31 1.56±0.16 0.46±0.18模型組 0.78±0.26△ 0.84±0.25△ 1.18±0.22△坤泰膠囊組 1.25±0.23* 1.24±0.20* 0.59±0.29*中西藥組 1.08±0.19* 1.36±0.27* 0.63±0.26*西藥組 1.12±0.28* 1.23±0.17* 0.82±0.34*

3.5 Smad2／3／7 蛋白表達(dá) 圖2、表4 顯示，與正常組比較，模型組Smad2／3 蛋白表達(dá)顯著降低，Smad7 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，坤泰膠囊組、中西藥組、西藥組（除Smad3 外） Smad2／3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），三組Smad7 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。與西藥組比較，坤泰膠囊組、中西藥組Smad3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖2 各組Smad2／3／7 蛋白表達(dá)

表4 各組Smad2／3／7 蛋白表達(dá)的比較n＝10）

表4 各組Smad2／3／7 蛋白表達(dá)的比較n＝10）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，＃P＜0.05

組別 Smad2 Smad3 Smad7正常組 0.60±0.20 0.61±0.02 0.18±0.02模型組 0.28±0.21△ 0.31±0.02△ 0.37±0.02△坤泰膠囊組 0.64±0.25* 0.51±0.23*＃ 0.20±0.15*中西藥組 0.55±0.04* 0.49±0.01*＃ 0.21±0.02*西藥組 0.59±0.02* 0.32±0.04 0.29±0.16*

4 討論

雷公藤多苷是一種細(xì)胞毒性藥物，對(duì)機(jī)體內(nèi)分裂增殖較快的細(xì)胞作用明顯，導(dǎo)致其DNA 堿基錯(cuò)配，引起DNA鏈斷裂，對(duì)卵巢的卵泡細(xì)胞有較強(qiáng)毒副作用，近年來(lái)被廣泛用于卵巢儲(chǔ)備功能下降模型的建立，該方法所需時(shí)間短，成功率高，簡(jiǎn)便易行，致病途徑與人類相同，而且符合模型卵巢組織萎縮，卵泡、黃體數(shù)量、卵泡顆粒細(xì)胞減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)等特點(diǎn)。造模劑量及時(shí)間參照文獻(xiàn)［9］，以50 mg／（kg·14 d） 造模最理想。

中醫(yī)并無(wú)“卵巢儲(chǔ)備功能下降” 這一病名，但可將其歸于“不孕癥” “月經(jīng)過(guò)少” “月經(jīng)后期” “血枯” “閉經(jīng)”等范疇，認(rèn)為腎藏精，主生殖，腎虛是本病根本病機(jī)，腎虛陰陽(yáng)失調(diào)，影響及心，心不靜則腎不實(shí)，久而必致腎虛，心腎子宮軸失調(diào)，產(chǎn)生各種復(fù)雜病變；國(guó)醫(yī)大師夏桂成認(rèn)為，本病主要病機(jī)為“心腎不交”，主要治法為“交濟(jì)心腎，以調(diào)心為主”。坤泰膠囊系由仲景名方“黃連阿膠湯”化裁而來(lái)，方中熟地、阿膠、白芍、茯苓滋腎陰，養(yǎng)精血，黃連、黃芩清熱瀉火，能有效改善因卵巢功能減退而引起的癥狀；現(xiàn)代藥理研究表明，方中熟地、白芍具有雌激素樣作用［12］，可升高 婦女血清E2 水平［13］； Huang 等［14］認(rèn)為，坤泰膠囊等中藥可能通過(guò)調(diào)節(jié)GnRH 分泌來(lái)促進(jìn)卵泡發(fā)育與排卵，改善子宮血流，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜。

卵巢儲(chǔ)備功能下降作為臨床常見(jiàn)病，其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響育齡女性生殖健康及生活質(zhì)量，目前主要圍繞卵泡生成障礙、卵泡耗竭加速來(lái)探討其機(jī)制［15］。TGF-β信號(hào)通路作為卵巢內(nèi)經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化，對(duì)卵泡發(fā)育許多階段都至關(guān)重要，包括原始卵泡形成、顆粒細(xì)胞增殖、卵泡閉鎖、排卵、垂體與卵巢之間反饋調(diào)節(jié)，其超家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是卵泡形成和排卵的關(guān)鍵調(diào)控途徑［16-21］。Smad 蛋白作為TGF-β 信號(hào)通路的下游信號(hào)傳導(dǎo)分子，在其信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要作用，受體調(diào)節(jié)型蛋白Smad2／3 被TGF-βⅠ型受體磷酸化和激活，磷酸化的Smad2／3 與共同調(diào)節(jié)型蛋白Smad4 結(jié)合形成異聚復(fù)合物，并通過(guò)募集不同轉(zhuǎn)錄因子、共激活因子、輔助受體在細(xì)胞核中累積以調(diào)節(jié)基因表達(dá)［22-23］，而Smad7 作為抑制型Smad 發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能［24-28］。研究表明，在缺乏Smad3 的情況下，F(xiàn)SH 上調(diào)其自身受體的能力下降，但當(dāng)其表達(dá)恢復(fù)時(shí)FSHR 表達(dá)增加， 恢復(fù)了它們對(duì)FSH 干預(yù)的反應(yīng)能力［29］。由于Smad2、Smad3 高度同源，故通過(guò)兩者發(fā)出的信號(hào)能增加培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中FSHR mRNA 表達(dá)［30-31］，而SMAD7 則在小鼠GCs 中介導(dǎo)由TGF-β 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，故可通過(guò)防止過(guò)早的GCs 凋亡來(lái)支持卵泡發(fā)育［32］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與正常組相比模型組大鼠E2、AMH 水平下降，F(xiàn)SH、LH 水平上升，Smad2／3 蛋白及mRNA 表達(dá)下降，Smad7 蛋白及mRNA 表達(dá)上升；坤泰膠囊干預(yù)后， 各項(xiàng)激素和Smad2／3／7 蛋白及mRNA 表達(dá)均有不同程度改善，可見(jiàn)各級(jí)卵泡發(fā)育，卵泡外圍包繞的顆粒細(xì)胞層數(shù)較模型組多，黃體數(shù)量較模型組多，發(fā)育尚可。FSH 參與調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，可見(jiàn)坤泰膠囊通過(guò)提高大鼠血清E2 水平，上調(diào)大鼠卵巢組織Smad2／3 表達(dá)來(lái)提高大鼠卵巢組織FSHR 表達(dá)，增加卵巢組織對(duì)FSH 的反應(yīng)性，降低血清FSH 水平；下調(diào)大鼠卵巢組織Smad7 表達(dá)，防止卵泡過(guò)早凋亡，從而促進(jìn)和維持卵泡生長(zhǎng)發(fā)育。

雖然本實(shí)驗(yàn)未對(duì)大鼠卵巢組織進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)坤泰膠囊可能通過(guò)提高大鼠E2 分泌水平，降低FSH、LH分泌，調(diào)控大鼠卵巢組織Smad2／3／7 表達(dá)（即上調(diào)Smad2／3表達(dá)，下調(diào)Smad7 表達(dá)），調(diào)控TGF-β／Smads 信號(hào)通路中正、負(fù)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)和維持卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，可能是其改善卵巢功能的機(jī)制。