王躍華, 屈錫梅, 任 倩, 史斯予， 王一品(.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 6006； .成都列五中學(xué)， 四川 成都 60007)

0 引 言

羌活為傘形科植物羌活或?qū)捜~羌活的干燥根莖和根，主要用于外感風(fēng)寒、頭痛無汗、寒濕痹、風(fēng)濕疼痛等癥.羌活主要含有揮發(fā)油、香豆素、有機(jī)酸、糖類及甾醇類化合物[1-2].羌活的主要藥效成分羌活醇和異歐前胡素屬于香豆素類，目前為止，羌活中發(fā)現(xiàn)的香豆素類化合物有64個[3-4].近年來，為了快速繁殖羌活以緩解羌活野生資源面臨的危機(jī)，科研人員利用組培技術(shù)來快速提高羌活的產(chǎn)量，取得了一系列成果[5-6].在此基礎(chǔ)上，本研究通過比較不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、蔗糖濃度、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比值、總氮含量等因素對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響，確定了羌活植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基條件，擬為后續(xù)的羌活植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實(shí)驗(yàn)所用材料，由固體培養(yǎng)基中以羌活芽鞘為外植體誘導(dǎo)出的淺黃色愈傷組織.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：植物激素NAA、2,4-D、6-BA，均購自成都科龍化工試劑廠.

1.1.2 儀 器.

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：SW-QJ-2F型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，HZQ-F160A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，LD型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 基本培養(yǎng)基的篩選.

配制基本培養(yǎng)基B5、MS、N6、White及H，同時添加激素6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L及蔗糖30 g/L配制成液體培養(yǎng)基.分裝100 mL培養(yǎng)基于250 mL的三角瓶中，調(diào)節(jié)pH值為6.0，滅菌后備用.取生長良好的淺黃色羌活愈傷組織，小心去掉表面殘存的培養(yǎng)基，用無菌水清洗3次，接種量約為2.0 g/100 mL接種至已滅菌的培養(yǎng)基中，接種之后再稱量，記錄實(shí)際的接種量.將三角瓶放置于搖床上振蕩培養(yǎng)，設(shè)定搖床參數(shù)90 r/min，25 ℃，光照時間8 h，光照強(qiáng)度800 lx，每2 d觀察1次，30 d后過濾得細(xì)胞培養(yǎng)物，在濾紙上吸干水分，獲得新鮮培養(yǎng)物，稱重，計(jì)算并篩選出最佳的培養(yǎng)基.每個處理3個重復(fù).

1.2.2 不同蔗糖濃度的MS液體培養(yǎng)基配制.

以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L作為懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并設(shè)置蔗糖濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，分裝等其他方法同“1.2.1".取生長良好的淺黃色羌活愈傷組織，小心去掉表面殘存的培養(yǎng)基，用無菌水清洗3次，接種量約為2.0 g/100 mL，接種完成之后再次稱重，記錄實(shí)際接種量.將三角瓶放置于搖床上震蕩培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件及統(tǒng)計(jì)

方法同“1.2.1".篩選出最佳蔗糖濃度.每個處理3個重復(fù).

1.2.4 不同總氮含量的MS液體培養(yǎng)基配制.

以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L作為懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，設(shè)置總氮含量分別為1/4 N、1/2 N、1 N、2 N共4個處理.1 N代表初始含氮量為MS培養(yǎng)基中總氮量不變(NH4NO3=1 650 mg/L，KNO3=1 900 mg/L)； 2N代表MS培養(yǎng)基中總氮量增加1倍(NH4NO3=3 300 mg/L，KNO3=3 800 mg/L)；以此類推，1/2 N為MS培養(yǎng)基總氮量的1/2(NH4NO3=850 mg/L，KNO3=950 mg/L)；1/4 N為MS培養(yǎng)基的總氮量的1/4(NH4NO3=425 mg/L，KNO3=475 mg/L).分裝等其他方法同“1.2.1".取生長良好的淺黃色羌活愈傷組織，小心去掉表面殘存的培養(yǎng)基，用無菌水清洗3次，接種量約為2.0 g/100 mL，接種完成之后再次稱重，記錄實(shí)際接種量.培養(yǎng)條件及統(tǒng)計(jì)方法同“1.2.1"，篩選出最佳總氮含量.每個處理3個重復(fù).

1.2.5 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的鮮重測量.

取在4 000 r/min的條件下離心10 min后去除上清液的羌活植物懸浮細(xì)胞，濾紙吸干表面水分，稱量鮮重，計(jì)算生物量增殖倍數(shù).實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.6 細(xì)胞生長測定計(jì)算公式以及數(shù)據(jù)分析.

細(xì)胞增殖倍數(shù)計(jì)算公式為，

細(xì)胞增殖倍數(shù)=(收獲時的鮮重-接種時的鮮重)/接種時的鮮重.

細(xì)胞生長速率換算成每天每升培養(yǎng)基增加的細(xì)胞重克數(shù)，即g/(L·d)，表示生長速率.即，

生長速率=(收獲時的鮮重-接種時的鮮重量)/(培養(yǎng)天數(shù)×培養(yǎng)液體積).

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基種類對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

本實(shí)驗(yàn)配制了B5、MS、N6、White及H 5種基本培養(yǎng)基，并添加激素6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L及蔗糖30 g/L，在250 mL三角瓶中裝入100 mL基本培養(yǎng)液，并接入2.0 g/100 mL分散良好的淺黃色羌活愈傷組織，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1.

表1 培養(yǎng)基種類對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

由表1可知，A1用MS作為基本培養(yǎng)基，羌活植物懸浮細(xì)胞增殖倍數(shù)和生長速率均最大，分別是2.185±0.031和(1.457±0.021) g/(L·d)，這是因?yàn)镸S屬于高鹽濃度的培養(yǎng)基，且含有NH4NO3，故最有利于羌活植物懸浮細(xì)胞的生長；在A3中，當(dāng)用White作基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，羌活植物懸浮細(xì)胞的增殖倍數(shù)和生長速率最低，這是因?yàn)閃hite為低鹽培養(yǎng)基，且White培養(yǎng)基不含銨鹽，并且各離子濃度都較低，故最不利于羌活懸浮細(xì)胞的生長；在A2和A4中，以B5和N6作為基本培養(yǎng)基時，由于B5和N6均含高濃度的硝酸鉀，但B5中含有較低濃度的銨，故以B5作為基本培養(yǎng)基時，羌活植物懸浮細(xì)胞的生長情況略好于以N6作為基本培養(yǎng)基時的生長情況；在A5中，由于H為中鹽基本培養(yǎng)基，故略高于以White作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響.結(jié)果表明，以MS作為基本培養(yǎng)基，最有利于羌活植物懸浮細(xì)胞的生長.

2.2 蔗糖濃度對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

在植物細(xì)胞中，蔗糖常常用作提供植物生長的標(biāo)準(zhǔn)碳源，能更好地維持培養(yǎng)基中的滲透壓[7]，本研究以不同濃度的蔗糖為碳源，在實(shí)驗(yàn)中以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并分別添加10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L不同濃度的蔗糖，配制5種培養(yǎng)液，并接入2.0 g/100mL的分散良好的淺黃色羌活愈傷組織，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2.

由表2可知， 羌活植物懸浮細(xì)胞的生長隨著蔗糖濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象.在B3中，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到30 g/L時，羌活植物懸浮細(xì)胞的增殖倍數(shù)和生長速率均最大，分別為2.185±0.031和(1.457±0.021) g/(L·d)，此條件下的羌活懸浮細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞分散性良好，呈淡綠色；在B1中，蔗糖濃度為10 g/L時，對羌活植物懸浮細(xì)胞的生長影響最低，這是由于蔗糖濃度過低，培養(yǎng)液中的蔗糖還不足以維持羌活植物細(xì)胞的生長，此時羌活植物懸浮細(xì)胞體積較小，形態(tài)變化不明顯；在B4～B5中，隨著蔗糖濃度的升高，羌活植物懸浮細(xì)胞的生長則受到抑制，這是因?yàn)檎崽亲鳛橄拗菩曰|(zhì)存在，當(dāng)濃度過高時影響了培養(yǎng)液中的滲透壓，且出現(xiàn)了基質(zhì)抑制效應(yīng)[8].結(jié)果表明，培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L時，最有利于羌活植物懸浮細(xì)胞的生長.

表2 蔗糖濃度對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

表比值對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

2.4 總氮含量對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

本實(shí)驗(yàn)配制4種不同總氮含量的MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接入2.0 g/100mL的分散良好的淺黃色羌活愈傷組織，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4.

表4 總氮含量對羌活植物懸浮細(xì)胞生長的影響

由表4可知，在F2培養(yǎng)基中，當(dāng)總氮含量為1/2 N時，羌活植物懸浮細(xì)胞的增殖倍數(shù)和生長速率達(dá)到最大，分別是2.703±0.025和(1.802±0.017) g/(L·d)，此時的羌活植物懸浮細(xì)胞生長狀態(tài)最佳；在F3和F4培養(yǎng)基中，隨著總氮含量的增加，羌活植物懸浮細(xì)胞的生長速率逐漸下降，也逐漸出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；在F4培養(yǎng)基中，當(dāng)總氮含量為2 N時的羌活植物懸浮細(xì)胞增殖倍數(shù)和生長速率降到最低，這說明低濃度的總氮含量比高濃度的總氮含量更利于羌活植物懸浮細(xì)胞的生長，且高濃度的總氮含量中，銨態(tài)氮的含量也會增加，對細(xì)胞會產(chǎn)生一定的毒性.因此，總氮含量為1/2 N時最有利于羌活植物懸浮細(xì)胞的生長.

3 結(jié) 論