劉金虎,馮帥帥,杜 源,慕宏杰,吳子梅

(煙臺大學藥學院,新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心(煙臺大學),山東 煙臺 264005)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是青少年中常見的一種惡性骨腫瘤．目前主要的治療方式為手術切除病灶加輔助化療[1-2]．然而,常規(guī)的化療藥物普遍缺乏選擇性,經(jīng)常給患者帶來各種毒副作用;同時骨的一些生理特點,如骨周圍的血流量少、結晶程度高、細胞受體特定等,使藥物很難穿透進入發(fā)揮療效[3]．

磷酸殼聚糖(phosphorylated chitosan,PCTS)是一種含有磷酸基團的殼聚糖衍生物．具有生物相容性好、生物可降解、無毒等特點,且水溶性比殼聚糖(chitosan,CTS)好．研究表明,借助于磷酸基團與Ca2+的螯合作用,PCTS可與羥基磷灰石(HAp)結合;PCTS多孔支架能明顯促進hFOB細胞的分化及新骨的形成;在骨組織工程中,PCTS可改善生物復合材料的壓縮強度等[4-6]．因此,PCTS與骨有良好的生物相容性．另外,針對原發(fā)性骨肉瘤骨中存在大量HAp的特點,人們已將HAp作為開發(fā)骨靶向制劑的重要靶點[7]．然而,研究者目前主要關注PCTS在骨組織工程方面的應用,卻忽視了它潛在的趨骨性;同時,由PCTS所修飾的藥物載體在動物體內的骨靶向能力尚不得而知．

磷酸殼寡糖(phosphorylated chitooligosaccharide,PCS)是由殼寡糖(chitooligosaccharide,CS)磷酸化形成的．它分子質量小、結構簡單、容易修飾,結構與PCTS相似,并且還能促進HAp的形成,在骨組織工程領域同樣顯示了良好的開發(fā)前景[8]．截至目前,PCS在體內的趨骨性也未見報道．本研究以PCS為研究對象,首先通過化學反應引入疏水的膽固醇(Chol),然后修飾到脂質體制備得到PCS-DOX-L．隨后,通過小動物活體成像考察PCS修飾脂質體在骨肉瘤荷瘤小鼠體內的骨靶向性．

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

粒度分析儀(Delsa Nano C,Beckman Coulter);酶標儀(Spectra Max M2,Molecular Devices);旋轉蒸發(fā)儀(RE-3000,上海亞榮生化儀器廠);紫外可見分光光度計(UV-9000,上海元析儀器有限公司);CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150i,Thermo Fisher Scientific);電子透射顯微鏡(TEM,JEM-1400 Plus,日本電子株式會社);小動物成像系統(tǒng)(In vivo FX Pro,Carestream Health)．

1.2 材料

大豆卵磷脂(大連美倫生物技術有限公司,批號A0809A);膽固醇(國藥集團化學試劑有限公司);鹽酸阿霉素(DOX·HCl,Ark Pharm,批號161208001);殼寡糖(CS,分子質量≤3 kU,濟南海得貝海洋生物工程有限公司);膽固醇琥珀酸單酯(CHEMS,梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,薩恩化學技術(上海)有限公司);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,成都艾科達化學試劑有限公司);透析袋(分子截留量MwCO=1 kU,西安優(yōu)博生物科技有限公司);五氧化二磷(P2O5,天津永大化學試劑公司);甲磺酸(天津光復精細化工研究所);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma);鉬酸銨(國藥集團化學試劑有限公司);KH2PO4基準品(上海山浦化工有限公司);烏氏粘度計(內徑0.58 mm,上海申立玻璃儀器有限公司)．

Balb/c裸鼠(18～25 g,常州卡文斯實驗動物有限公司);骨肉瘤MG63細胞(中國科學院上海細胞庫);胎牛血清(FBS,Gibco,Life Technologies Corporation);MEM培養(yǎng)基(Gibco,Life Technologies Corporation);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Sigma);青霉素-鏈霉素雙抗試劑(HyClone,GE Healthcare Life Corporation);0.25%胰蛋白酶(HyClone,GE Healthcare Life Sciences);DiR染料(北京富百科生物技術有限公司);其余化學試劑均為分析純．

2 方 法

2.1 殼寡糖-膽固醇接枝聚合物(CS-Chol)的合成

采用羧酸與氨基的縮合反應合成CS-Chol．方法如下:稱取CHEMS 24.3 mg、EDC·HCl 38.3 mg和 NHS 23.0 mg溶于DMSO中,然后于55 ℃加熱活化CHEMS的羧基．另取CS 300 mg,同樣溶于DMSO中．然后,將活化好的CHEMS溶液向CS溶液中逐滴加入,反應于55 ℃下進行24 h．待反應結束后,將溶液轉移到透析袋(MwCO=1 kU)中,共透析48 h,然后取袋中的上清液凍干,得到CS-Chol．

2.2 磷酸殼寡糖-膽固醇接枝聚合物(PCS-Chol)的合成

本反應為殼寡糖的磷酸化反應,參照WANG K P等[9]的方法,反應步驟如下:稱取第一步產(chǎn)物100 mg并溶于甲磺酸中．在冰浴條件下將P2O550 mg緩慢加入到上述甲磺酸溶液中,反應進行3 h．反應結束后向溶液中加入過量的冷乙醚,同時不斷快速攪拌使沉淀析出．離心后,收集沉淀．然后用丙酮和乙醇重復上述步驟各一次．待離心結束后,收集離心管中的沉淀．然后,用適量的去離子水復溶并轉移至透析袋(MwCO=1 kU)中．透析48 h后,凍干．即得PCS-Chol．

2.3 聚合物的結構表征

分別將CS-Chol、PCS-Chol粉末與適量的KBr混合、壓片,然后用紅外光譜儀進行紅外掃描(掃描范圍為4 000～400 cm-1)．另稱取適量的 PCS-Chol粉末,用D2O溶解后由核磁共振儀(400 MHz)進行31P-NMR的測定．

參照MA Y K等[10]的方法,用TNBS法分別測定2種聚合物上Chol的取代度,記為DSChol．用強酸將PCS-Chol降解后,采用鉬酸銨比色法測定PCS-Chol中磷的取代度[11],記為DSP．

2.4 聚合物的特性黏度

運用烏氏黏度計測定兩種聚合物的特性黏度．參照文獻[12]的方法,用黏度計分別依次測定PCS-Chol溶液在一系列不同濃度下(C)的增比黏度(ηsp),然后以ηsp/C對C進行線性回歸,所得直線與縱軸的截距即為該聚合物的特性黏度．CS-Chol同樣按照上述方法進行測定．

2.5 脂質體的制備

PCS修飾阿霉素脂質體(PCS-DOX-L)的制備過程共分2步進行:首先采用逆相蒸發(fā)結合(NH4)2SO4梯度法制備DOX脂質體(DOX-L),然后用后插入法將PCS-Chol插入到DOX-L的表面,即得PCS-DOX-L．具體操作過程如下:準確稱取大豆卵磷脂36 mg和膽固醇9 mg于圓底燒瓶中,然后加入適量甲醇與氯仿組成的混合溶劑(2∶1,V/V)使它們溶解．接著,向其中再加入適量250 mmol/L (NH4)2SO4溶液并探頭超聲,最終形成穩(wěn)定的W/O型乳劑．待旋轉蒸發(fā)除掉有機溶劑后,繼續(xù)加入(NH4)2SO4溶液并水化膜材．待形成脂質體混懸液后,將溶液分別依次擠壓通過0.45 μm和0.22 μm孔徑的微孔濾器,最終得到空白脂質體．

采用主動載藥法包載DOX．其步驟為:首先,利用透析法除掉脂質體外水相中游離的(NH4)2SO4;然后,將DOX·HCl溶液(濃度為3 mg/mL,藥脂比=24∶1)逐滴加入到上述脂質體溶液中,45 ℃孵育1 h,此時得到DOX-L．

配制0.2%(W/V)PCS-Chol溶液的方法如下:準確稱取適量的PCS-Chol凍干粉,然后用pH值為4.5的醋酸鹽溶液溶解并調整至最終濃度即得．向DOX脂質體溶液中逐滴加入上述聚合物溶液(大豆卵磷脂:PCS=6∶1,W/W)后,在室溫下緩慢攪拌1 h,并于4 ℃保存過夜,即得PCS-DOX-L．

CS-DOX-L作為對照組,制備過程與上述步驟基本相同．

CS-L和PCS-L為不含DOX的空白脂質體,制備過程除載藥外,其他操作同上．

2.6 脂質體的表征

2.6.1 粒徑分布和zeta電位 利用粒度分析儀分別測定普通脂質體、CS-L和PCS-L的粒徑分布和zeta電位．

2.6.2 包封率和載藥量 采用超濾離心法測定脂質體的包封率,參照XU H等[13]并略有改進:精密量取一定量的DOX-L、CS-DOX-L及PCS-DOX-L溶液,置于離心管中(MwCO=100 U)．然后,超速離心30 min,轉速為3 000 r/min．待離心結束后,取出超濾液,進入HPLC系統(tǒng),計算游離藥物的含量．另精密量取上述脂質體溶液適量,加入甲醇超聲破乳并用0.2 μm微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液,進入HPLC系統(tǒng),計算脂質體的總藥量．按式(1)、(2)分別計算脂質體的包封率和載藥量:

包封率=(向脂質體投入的總藥量-游離的藥量)/向脂質體投入的總藥量)×100%,

(1)

載藥量=(脂質體的總藥量-游離的藥量)/脂質體的總質量×100%．

(2)

2.7 形態(tài)

利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察普通脂質體和PCS-L的外部形態(tài)．方法如下:吸取經(jīng)過稀釋的脂質體溶液1滴,滴加到銅網(wǎng)上．待風干后,再加入1滴2%磷鎢酸染液進行染色．用濾紙吸走多余的染液后,在TEM下進行觀察．

2.8 體外釋放

分別精密量取DOX溶液、CS-DOX-L和PCS-DOX-L 1 mL,放置于透析袋中(MwCO=1 kU)．隨后浸入到30 mL pH值為7.4或5的PBS溶液(含0.5%吐溫80)中．采用恒溫振蕩法,37 ℃,100 r/min進行體外釋放．每隔一段時間從溶液中吸取2 mL釋放介質,同時補加等體積新鮮的介質．由HPLC測定釋放介質中DOX的含量,然后計算累計釋放度并繪制釋放曲線．

2.9 體外細胞毒性

取對數(shù)生長的MG63細胞,用含有FBS的MEM培養(yǎng)基稀釋后接種于96孔板上,接種數(shù)量為1×104個細胞/孔．培養(yǎng)過夜后,向孔內依次加入不同濃度的DOX溶液、CS-DOX-L及PCS-DOX-L．每個濃度設4個復孔．繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后,向每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h．隨后,吸掉培養(yǎng)基并分別向孔內加入150 μL DMSO．待37 ℃水浴震蕩10 min后,用酶標儀在570 nm處測定各孔的吸光度(A570),然后分別計算各制劑不同濃度下的細胞生存率:

細胞生存率=給藥組A570/陰性對照組A570×100%.

2.10 荷瘤裸鼠的組織分布研究

2.10.1 動物模型的建立 取Balb/c裸鼠,用4%水合氯醛麻醉后,在其右肢脛骨的骨髓腔內注射骨肉瘤MG63細胞懸液0.1 mL(接種數(shù)量為5×106/只);在左肢的相應位置不作處理,設為對照組．每天觀察裸鼠的生長狀況,每隔一天測量腫瘤的長(a)和寬(b)，按式(3)計算腫瘤的體積:

V(mm3)=a×b2/2．

(3)

2.10.2 DiR脂質體的制備 采用逆相蒸發(fā)結合被動載藥法制備包載DiR的各種脂質體．方法如下:準確稱取卵磷脂36 mg、膽固醇9 mg及DiR 0.2 mg,用適量的氯仿與甲醇的混合溶劑溶解后,短時超聲使形成穩(wěn)定的初乳．待旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑后,向溶液中加入適量的PBS(pH值為7.4)水化膜材．形成脂質體混懸液后再依次經(jīng)過0.45 μm、0.22 μm孔徑的濾膜,便得到分布均一、粒徑為200 nm左右的DiR-L．由DiR-L制備形成CS-DiR-L和PCS-DiR-L的步驟同2.5．另稱取磷脂(33 mg)、膽固醇(9 mg)、DSPE-PEG2000(7 mg)和DiR(0.2 mg),同樣按照上述步驟操作,最終得到PEG-DiR-L．FreeDiR是由DiR乙醇溶液(1 mg/mL)與適量聚氧乙烯、蓖麻油、生理鹽水混合而成，作為對照。

2.10.3 組織分布研究 以DiR為示蹤物質,將其包載于脂質體后,定性考察各種脂質體在小鼠體內的分布情況．實驗過程如下:當裸鼠的腫瘤體積長至約100 mm3時,將裸鼠隨機分為4組,每組3只．對上述4種制劑(Free DiR、PEG-DiR-L、CS-DiR-L和PCS-DiR-L)均按照20 μg DiR/只的劑量分別依次從裸鼠的尾靜脈注射給藥．從注射結束開始計時,分別于5 h、12 h和24 h,利用小動物活體成像系統(tǒng)拍攝各種制劑在裸鼠體內的分布情況(激發(fā)波長為720 nm,發(fā)射波長為790 nm)．

待上述實驗結束,立即處死動物．然后解剖、分離并收集心、肝、脾、肺、腎及帶有腫瘤的右肢,同樣置于小動物成像儀下進行觀察．

2.11 分析方法

HPLC系統(tǒng)由Agilent 1260泵、1260 VWD檢測器和Gensial C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,廣州研創(chuàng)生物技術發(fā)展有限公司)組成．流動相的組成為乙腈-醋酸鹽緩沖液(pH值為4)(40∶60,V/V)．流速為1 mL/min．溫度為28 ℃．DOX的標準曲線為A=17.710C+3.765 3 (r=0.999 8),在0.5 ～ 25 μg/mL范圍內線性關系良好．

3 結 果

3.1 聚合物的結構表征

在EDC和NHS的催化作用下,CHEMS上的羧基與CS的氨基之間發(fā)生?；磻?生成CS-Chol．隨后,在甲磺酸中P2O5與CS-Chol骨架上的羥基反應,生成磷酸化的聚合物,即PCS-Chol．CS-Chol與PCS-Chol的化學結構見圖1,表征它們結構的FT-IR和PCS-Chol的31P-NMR圖見圖2．

圖1 CS-Chol和PCS-Chol的結構式

由圖2(a)可知,在聚合物CS-Chol中,2 936和2 885 cm-1處的吸收峰來自于膽固醇vCH的吸收峰;1 644 cm-1處的吸收峰來自于酰胺鍵的vC=O,是由CHEMS與CS之間發(fā)生反應后生成的．1 077 cm-1處的強峰是由CS上vC-O-C產(chǎn)生的．此外,在1 385 cm-1處的吸收峰也是該聚合物的特征峰之一．

圖2 兩種聚合物的紅外圖譜和PCS-Chol的核磁磷譜

Fig.2 FT-IR spectra of two polymers and31P-NMR spectrum

of PCS-Chol

就PCS-Chol而言,在2 936、2 885、1 644、1 077 cm-1等吸收峰同樣存在,表明該聚合物基本保留著前一步產(chǎn)物的結構．然而,它在1 385 cm-1處的吸收峰卻顯著增強了,這可能與引入的磷酸根離子vP=O的振動有關;并且在566 cm-1處也有吸收峰,可能是由P-OH所引起的[14]．隨后對該化合物進行了31P-NMR(D2O, 400 MHz)檢測,結果如圖2(b)所示,在δ=3.8處有一個核磁峰,這說明PCS-Chol中含有磷元素．綜合上述分析,可判斷成功合成出了CS-Chol和PCS-Chol．

經(jīng)過測定,CS-Chol和PCS-Chol上Chol的取代度分別為(90.9 ± 1.2)%和(82.0 ± 1.1)%,二者相差不大;說明在進行磷酸化反應時,甲磺酸沒有顯著地改變聚合物中糖鏈與Chol的比例．經(jīng)過計算,PCS-Chol上P的取代度為(3.9 ± 0.4)%．據(jù)報道,該磷酸化反應主要發(fā)生在CS的C-6羥基上[9],其次為C-3位．

3.2 聚合物的特性黏度

經(jīng)過測定,CS-Chol和PCS-Chol的特性黏度分別為51.8和60.4 mL/g,二者相差不大．

3.3 脂質體的理化性質

3種DOX脂質體的理化性質,包括粒徑、PDI、zeta電位、包封率和載藥量等結果見表1．

表1 普通阿霉素脂質體(DOX-L)、殼寡糖-阿霉素脂質體(CS-DOX-L)和磷酸殼寡糖-阿霉素脂質體(PCS-DOX-L)的表征

CS-DOX-L和PCS-DOX-L的粒徑分別為245.3 ± 2.6 nm和209.5 ± 0.5 nm;而未經(jīng)修飾的DOX-L的平均粒徑為196.4 ± 2.9 nm．這表明采用后插入法修飾脂質體會使粒徑增加．未經(jīng)修飾的DOX-L,zeta電位為-5.59 ± 0.48 mV,而經(jīng)過修飾之后的CS-DOX-L和PCS-DOX-L,電位則分別為13.67 ± 0.96 mV和6.28 ± 0.08 mV;說明經(jīng)聚合物修飾后脂質體的電位會發(fā)生改變．另外還發(fā)現(xiàn)PCS-DOX-L的電位比CS-DOX-L略?。瓺OX-L、CS-DOX-L和PCS-DOX-L的包封率依次為(92.5 ± 0.9)%、(86.2 ± 5.9)%和(85.4 ± 2.2)%．這說明經(jīng)過修飾后2種脂質體包封率雖略有下降,但降幅不大．

3.4 脂質體的形態(tài)

普通脂質體和PCS-L的外觀形態(tài)見圖3．從圖3可以看到2種脂質體呈球形、大小分布比較均勻．普通脂質體(a)的粒徑大約為100 nm,而經(jīng)過聚合物修飾的PCS-L(b),其粒徑則大于100 nm．這與DLS測定的結果相符,進一步證明加入聚合物后,脂質體的粒徑增加了．

此外,TEM圖中脂質體的粒徑比DLS的結果偏?。@是由于在TEM的制樣過程中,脂質體會失去部分水分,造成脂質體皺縮、粒徑減?。?/p>

3.5 體外釋放

不同DOX制劑在pH值為7.4和5條件下的體外釋放結果見圖4．

如圖4所示,DOX溶液在pH值為7.4和5的2種介質中快速釋放,在2 h時便全部釋放到溶液中了,與所處溶液的pH無關．相比之下,CS-DOX-L的釋放要明顯慢于DOX溶液:在pH值為7.4和5的2種介質中48 h的累積釋放度分別為(69.1±11.2)%、(89.9±3.0)%;且釋放程度與pH值有關,即隨著溶液酸性的增加,釋放隨之加快．PCS-DOX-L的釋藥過程與CS-DOX-L相似:在pH值為7.4時48 h的累積釋放度為(44.8±0.9)%,而在pH值為5的釋放度則達到了(80.1±4.5)%,且同樣慢于DOX溶液,也體現(xiàn)了緩慢釋藥和pH敏感的特點．

圖3 普通脂質體和PCS脂質體的透射電鏡圖

圖4 不同DOX制劑在pH=7.4和5條件下的體外釋放曲線

3.6 細胞毒活性

3種DOX制劑與MG63細胞分別作用24 h和48 h均引起細胞的生存率不斷下降,表明它們對該細胞的毒性具有時間和濃度雙依賴性的特點(表2)．然而,2種脂質體之間并沒有一致的趨向性;而且在很多濃度下PCS-DOX-L引起細胞的生存率比CS-DOX-L高(P<0.05),說明該脂質體的毒性稍微減弱了．

3.7 組織分布

在注射不同DiR制劑后,MG63荷瘤裸鼠的活體和離體組織分布結果如圖5所示．

Tab.2 The effects of DOX solution, CS-DOX-L and PCS-DOX-L on the survival rate of MG63 cells at different time points

時間/hDOX制劑DOX濃度/(μg·mL-1)0.310.621.252.551020 Free DOX90.3±3.681.5±1.469.0±3.175.9±5.669.2±4.466.4±4.959.7±3.724CS-DOX-L92.1±2.782.1±10.167.5±4.468.6±6.975.0±3.970.2±5.252.8±3.0PCS-DOX-L89.2±6.084.1±2.983.6±9.0?67.0±5.073.6±2.773.3±6.266.9±5.2? Free DOX40.9±1.024.9±0.739.2±1.038.8±3.132.6±1.130.4±0.020.1±0.548CS-DOX-L42.8±2.031.2±4.231.4±1.238.9±0.835.3±2.615.6±1.68.3±1.1PCS-DOX-L63.8±7.0?44.3±2.1?35.3±2.632.8±2.6?37.9±0.634.2±1.6?15.5±1.7?

注:與CS-DOX-L比較,*P<0.05.

向小鼠尾靜脈分別注射上述4種DiR制劑后的體內分布結果見圖5(a)．DiR溶液在注射給藥5 h時的熒光信號主要分布于肝臟;隨著時間推移,在第12 h和24 h時熒光仍然主要分布于該器官．PEG-DiR-L是由PEG修飾的長循環(huán)脂質體,其熒光信號也主要分布于肝臟,但在骨上卻始終未出現(xiàn)過熒光信號．CS-DiR-L在注射12 h后于鼠右肢的關節(jié)處開始出現(xiàn)少量的熒光,但到24 h時信號消失不見了．相比之下,PCS-DiR-L從注射后第5 h至24 h在鼠的右肢上一直有熒光存在;表明PCS脂質體靶向于骨的能力超過了CS脂質體．相比之下,無論是CS-DiR-L還是PCS-DiR-L,在裸鼠左肢的關節(jié)處則始終未出現(xiàn)過熒光;這表明2種脂質體均有一定的骨肉瘤靶向性．

熒光信號在各離體組織的分布結果如圖5(b)所示．上述4組制劑都在肝臟有最明顯的熒光區(qū)域,其次在脾．肺部的熒光信號以游離的DiR組最明顯．CS-DiR-L在脾臟的熒光信號則比其他制劑更加突出．PCS-DiR-L在鼠右肢處的熒光最明顯,與圖5(a)結果一致;表明PCS修飾的脂質體確實能進入到癌變的骨組織上,有最強的骨靶向能力．

圖5 不同DiR制劑在荷瘤裸鼠(a)和離體組織(b)的分布

4 討 論

骨肉瘤主要發(fā)生在人體的長骨上,惡性程度高、易發(fā)生肺轉移,臨床治療難度大[15]．為了提高治療的效果,宜采用骨靶向制劑．PCS與HAp有良好的生物相容性,目前已在骨組織工程領域有廣泛的應用．本研究首次將PCS應用到藥物載體領域,嘗試探討了PCS脂質體在體內對OS的骨靶向能力．

以CS為原料,分2步合成出了PCS-Chol,通過FT-IR和核磁對它的結構進行了確認,對CS-Chol和PCS-Chol上的DSChol、DSP和特性黏度等依次進行了考察．結果表明,它們之間的DSChol相差不大,意味著這2種聚合物對脂質體的修飾效率基本相同．PCS-Chol上接枝了約4%的磷酸基團．CS-Chol和PCS-Chol的特性黏度分別為51.8、60.4 mL/g;二者相差不大,排除了粘性對產(chǎn)生骨靶向作用所帶來的顯著影響．

依次用逆相蒸發(fā)、主動載藥和后插入法制備得到了PCS-DOX-L．就目前的工藝而言,制備脂質體的步驟相對簡單,所形成脂質體的粒徑合適(約200 nm),能保證脂質體通過EPR效應進入腫瘤部位,且包封率較高(85%左右),基本滿足靜脈注射治療骨肉瘤的要求．本研究未對處方進行優(yōu)化,下一步的研究中將進一步探索處方的優(yōu)化篩選．Chol為脂質體的組成成分,以它為疏水部分有利于順利完成PCS-Chol對脂質體的修飾．此外,用后插入法可以避免周圍環(huán)境如電解質的影響,使PCS-DOX-L能更穩(wěn)定地存在于各種外界環(huán)境中[16]．

比較2種脂質體發(fā)現(xiàn),PCS-L的電位值小于CS-L．這是由于磷酸根離子在生理條件下會抵消CS-L的一些正電荷,故PCS-L的電位小于CS-L．眾所周知CTS會造成溶血,故它的安全性已經(jīng)引起人們的廣泛關注．據(jù)報道PCTS在血液中的相容性好,血小板活性弱于CTS[17]．本研究在之前的溶血實驗也證實PCS-L的血液安全性要好于CS-L．后插入法對PCS-DOX-L修飾前后包封率的影響不大,表明聚合物的Chol部分插入到脂質體后不會顯著影響脂質體膜的組成．

納米制劑的穩(wěn)定性與電位有關．一般認為納米粒子zeta電位的絕對值在30 mV以上才能保證粒子的穩(wěn)定．所制備的PCS-DOX-L的電位偏小,在4 ℃保存時易發(fā)生聚集,故穩(wěn)定性較差．后來將其做成凍干品,很好地解決了穩(wěn)定性差這一問題．

PCS-DOX-L的釋藥具有緩釋和pH敏感的特點．可能與PCS-Chol能降低脂質體膜的流動性以及在酸性條件下加速從脂質體上游離下來有關[18]．脂質體的pH敏感性將有助于藥物在體內更好地發(fā)揮作用:當脂質體隨血液運輸時,中性環(huán)境會降低DOX從脂質體的釋放,避免了藥物的過早代謝以及所帶來的不良反應;到達腫瘤組織或進入腫瘤細胞時,弱酸性環(huán)境則會加速DOX的釋放,提高了藥物的靶向性以及療效．

與DOX溶液相似,2種DOX脂質體對MG63細胞的毒性也表現(xiàn)出時間依賴和濃度依賴的特點．本課題組之前證實帶有正電荷的CS-DOX-L能依靠靜電吸附作用被MG63細胞攝取而發(fā)揮抗腫瘤作用[19]．相應地,PCS-DOX-L也帶有正電荷,同樣可以被該細胞攝取而殺傷細胞．然而,某些濃度下PCS-DOX-L的毒性要弱于CS-DOX-L,并且2種脂質體之間的毒性沒有體現(xiàn)出一致的趨向性．這可能與PCS-DOX-L所帶電荷的數(shù)量偏少,與細胞產(chǎn)生靜電吸附的能力較差,以及這些脂質體缺乏針對該細胞的靶點有關．本研究主要解決了PCS-DOX-L在體內的骨靶向問題,后續(xù)實驗可以考慮針對該細胞的靶點進行修飾．盡管如此,動物體內的環(huán)境要比體外復雜得多,體內的某些酶,如堿性磷酸酯酶會促進磷酸根離子的水解而可能提高療效[20]．相關的藥效學實驗還需今后在動物模型上進行評價．

通過小動物活體成像技術定性考察了各種制劑的組織分布情況,結果表明PCS-DiR-L具有較強靶向于骨肉瘤的能力．雙磷酸鹽是目前常用的骨靶向分子,它通過P-C-P骨架上的磷酸根離子與骨中的HAp發(fā)生螯合而產(chǎn)生骨靶向[3]．CHANG Q[21]等證明膜材中含有大量磷酸離子的脂質體比相應不含磷酸的脂質體有明顯的骨靶向性．因此,推斷PCS脂質體上的磷酸基團是發(fā)揮骨靶向的關鍵．當脂質體經(jīng)過血管的EPR效應到達癌變的骨組織時,磷酸根離子會與HAp的Ca2+發(fā)生螯合,從而使脂質體滯留于骨骼上;接著,骨周圍的腫瘤細胞依靠靜電作用將脂質體攝取;進入細胞后的脂質體不斷釋放藥物發(fā)揮藥效．正常骨周圍的血管無EPR效應,故PCS-DiR-L無法到達并產(chǎn)生熒光．CS-DiR-L同樣也能通過EPR效應到達癌變的骨組織,然后借助CS較弱的螯合或粘附作用使脂質體滯留于此并產(chǎn)生信號;然而由于缺乏像磷酸根那樣能與HAp產(chǎn)生強螯合作用的基團,因此與骨骼的親和性相對較弱,熒光持續(xù)的時間也不如PCS-DiR-L長[22]．DiR溶液和PEG-DiR-L則無法與骨產(chǎn)生親和作用,故無靶向性．

DiR和DOX之間的理化性質有差異,包載進入脂質體的方式也不盡相同,因此DOX脂質體在動物體內的行為不能完全用DiR脂質體來解釋．本研究是用DiR脂質體定性考察了PCS的骨靶向性，下一步本課題組將對PCS-DOX-L在MG63荷瘤小鼠的組織分布情況作深入的研究．

5 結 論

本研究首次將PCS應用到納米藥物載體領域．首先制備出磷酸殼寡糖-膽固醇接枝物(PCS-Chol),修飾得到了磷酸殼寡糖-阿霉素脂質體(PCS-DOX-L)．該脂質體的粒徑較小,包封率較高,能滿足靜脈注射和被動靶向治療骨肉瘤的要求;體外釋放具有pH響應和緩釋的特性．MTT實驗表明該脂質體隨時間和濃度的變化能不同程度地抑制MG63細胞的增殖．在荷瘤裸鼠的組織分布實驗證實PCS是良好的骨靶向分子,用它修飾脂質體后可以實現(xiàn)對骨肉瘤的靶向遞送．