戴凌虹，孫云，陳祥艷

（溫州市中醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325000）

卵巢癌是女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，手術(shù)是其首選治療方案，但高轉(zhuǎn)移率導(dǎo)致難以清除轉(zhuǎn)移病灶，對(duì)臨床預(yù)后產(chǎn)生較差影響[1]。經(jīng)手術(shù)后放、化療患者有多達(dá)75%復(fù)發(fā)，且5年生存期僅為30%～40%[2-3]。中草藥綜合治療卵巢癌的優(yōu)勢(shì)在臨床中日益突顯，不僅可特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而且對(duì)正常組織傷害小，從中草藥中尋找安全有效的抗腫瘤藥物已成為研究熱點(diǎn)。莪術(shù)醇是從姜黃根莖中提取的一種黃酮類(lèi)小分子化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效[4]。莪術(shù)醇能誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡，但目前對(duì)莪術(shù)醇作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞的具體機(jī)制研究甚少。本研究旨在觀察莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，并以PI3K/AKT通路為靶點(diǎn)，探討莪術(shù)醇的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 藥品:莪術(shù)醇，相對(duì)分子質(zhì)量為236.35 kDa，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111463-201708，于使用前用無(wú)水乙醇溶解，并用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.1.2 試劑與主要儀器:卵巢癌SKOV3細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LY294002購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗鼠PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；CCK-8試劑盒、羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；CO2培養(yǎng)箱、MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于5%的CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔2～3 d胰酶消化并傳代。在SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定、呈對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/L，每孔100 μL分別接種于2 塊96孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液。配制終濃度為5、10、25、50、100 μmol/L的莪術(shù)醇溶液，每孔加入100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 μL的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，分析莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50值（48 μmol/L）。0 μmol/L莪術(shù)醇為對(duì)照組。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，胰酶消化后，接種至6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，每孔垂直于6孔板劃3條平行線(xiàn)，造成細(xì)胞劃痕；吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，分為藥物組和對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔；藥物組給予終濃度為48 μmol/L的莪術(shù)醇溶液，0 μmol/L莪術(shù)醇為對(duì)照組；培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別記錄藥物干預(yù)6、12、24 h后的細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)侵襲能力:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，溶液干預(yù)24 h后，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，取200 μL接種于Transwell小室上層，將其置于滅菌的24孔板，小室下層加入培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，取出小室基底膜，用甲醇固定10 min，蘇木精染色，隨機(jī)取10個(gè)視野，高倍鏡下記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞接種于6孔板中，加入藥物干預(yù)處理24 h，收集上清液并用PBS洗滌2 次，收集全細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌，沉淀用Binding Buffer重懸，依次加入Annexin V-FITC、Propidium Iodide，混勻，室溫下避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá): 收集細(xì)胞樣本，加入一定量RIPA液裂解，于4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液為細(xì)胞蛋白樣本，測(cè)定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣跑電泳，完成后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入稀釋后的一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日用TBST液洗滌條帶3次，每次15 min，加入二抗室溫下孵育4 h，洗滌，顯影。應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用±s 表示，計(jì)數(shù)資料用百分率表示。2組間比較用t 檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析；兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響莪術(shù)醇濃度為10 μmol/L時(shí)對(duì)SKOV3細(xì)胞有較為明顯的增殖抑制作用，且抑制率隨著藥物濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但同濃度下藥物干預(yù)48 h與干預(yù)24 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。計(jì)算24 h時(shí)莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50值約為48 μmol/L，取該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移的影響與對(duì)照組比較，莪術(shù)醇干預(yù)12 h后的細(xì)胞劃痕面積比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；24 h時(shí)對(duì)照組細(xì)胞劃痕面積比顯著縮小，細(xì)胞愈合明顯，而在莪術(shù)醇干預(yù)完成后，劃痕面積比縮小趨勢(shì)較緩，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲的影響Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組跨膜細(xì)胞數(shù)明顯多于莪術(shù)醇組跨膜細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

2.4 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比，莪術(shù)醇干預(yù)24 h后SKOV3細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2和圖2。

2.5 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響與對(duì)照組比，莪術(shù)醇組SKOV3細(xì)胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)均有明顯的下降，但對(duì)磷酸化蛋白表達(dá)的影響明顯強(qiáng)于總蛋白，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；給予PI3K/AKT通路特異性阻斷劑LY294002干預(yù)后，莪術(shù)醇組與莪術(shù)醇聯(lián)合LY294002組間PI3K、AKT表達(dá)無(wú)明顯變化，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但與莪術(shù)醇組比，莪術(shù)醇聯(lián)合LY294002組p-PI3K、p-AKT表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖1 不同濃度的莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用

表1 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移率的影響（每組n=3，±s，%）

表1 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移率的影響（每組n=3，±s，%）

與對(duì)照組比:aP ＜0.05，bP ＜0.01

?

表2 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲和凋亡的影響（每組n=3±s）

表2 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲和凋亡的影響（每組n=3±s）

與對(duì)照組比:aP ＜0.01

?

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

3 討論

據(jù)國(guó)家癌癥中心資料，我國(guó)每年卵巢癌新發(fā)病例數(shù)約為5.21萬(wàn)人，死亡病例數(shù)約為2.25萬(wàn)人，死亡率位居?jì)D科惡性腫瘤的首位[5]。手術(shù)加放、化療是臨床治療卵巢癌的主要手段，但存在易復(fù)發(fā)、預(yù)后差、副作用大等缺點(diǎn)；中藥在惡性腫瘤的治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前腫瘤疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療法受到醫(yī)學(xué)界越來(lái)越多人的關(guān)注與認(rèn)可[6]。莪術(shù)醇作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥莪術(shù)的主要抗腫瘤成分，具有抑制肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌等多種癌細(xì)胞增殖的作用[7]。有關(guān)莪術(shù)醇抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，但對(duì)癌細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制的報(bào)道甚少，且其調(diào)節(jié)機(jī)制在分子水平也沒(méi)有詳細(xì)闡明。

本研究從不同時(shí)間不同濃度觀察莪術(shù)醇對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能明顯抑制SKOV3細(xì)胞增殖，并呈一定的劑量依賴(lài)性，但干預(yù)48 h與24 h對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并不呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴(lài)性。根據(jù)莪術(shù)醇干預(yù)SKOV3細(xì)胞24 h時(shí)的抑制率結(jié)果，計(jì)算IC50值約為48 μmol/L，考慮到大于該濃度后莪術(shù)醇的抑制率增長(zhǎng)緩慢，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用48 μmol/L莪術(shù)醇干預(yù)，時(shí)間為24 h。

惡性腫瘤治療的難點(diǎn)之一就是腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲造成體內(nèi)轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療造成很大阻礙，而腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲是在細(xì)胞具有增殖能力的前提下進(jìn)行的，本研究在明確莪術(shù)醇增殖抑制效果的基礎(chǔ)上，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能顯著抑制SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、凋亡、轉(zhuǎn)移等，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)均存在表達(dá)失調(diào)[9]。研究證明，PI3K/AKT信號(hào)通路與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是卵巢癌發(fā)病機(jī)制研究及治療藥物篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[10]。PI3K/AKT激活后通過(guò)調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的活性發(fā)揮抗凋亡作用，因此，抑制PI3K/AKT通路可以阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或發(fā)展[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能使SKOV3細(xì)胞PI3K、AKT總蛋白表達(dá)降低，同時(shí)顯著降低其磷酸化程度，表明其主要是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT磷酸化，抑制該通路激活而發(fā)揮作用；本研究進(jìn)一步采用PI3K/AKT通路特異性阻斷劑LY294002聯(lián)合干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能與阻斷劑展現(xiàn)出良好的協(xié)同增效作用，說(shuō)明莪術(shù)醇抑制SKOV3細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用與調(diào)控PI3K/AKT通路有關(guān)。

圖3 莪術(shù)醇對(duì)SKOV3細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞有明顯抗腫瘤活性，能明顯抑制該腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)其凋亡，且PI3K/AKT通路在上述過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究為莪術(shù)醇治療卵巢癌的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其更多潛在的抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。