佘臣杰,唐婕琳，何 環(huán),2，張 朦，童 麗,唐 俊，陶秀祥,2

(1.中國礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116; 2.中國礦業(yè)大學(xué) 煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點實驗室，江蘇 徐州 221116; 3.中國礦業(yè)大學(xué) 安全工程學(xué)院，江蘇 徐州 221116)

筆者利用SRB菌株聯(lián)合稻殼的簡易生物反應(yīng)器處理人工合成酸性重金屬廢水，分析酸性廢水在處理過程中理化特性(Eh，pH，Ec)及金屬離子(Fe，Mn，Cr)變化規(guī)律，并利用FT-IR分析稻殼和微生物聯(lián)合處理作用下重金屬離子的處理特性，分析SRB處理酸性重金屬廢水的金屬沉淀的生物作用機制，希望通過這些研究為矸石山重金屬污染治理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

本試驗采用的SRB菌株篩選自湖南湘潭某矸石山周邊土壤，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定SRB菌屬于Desulfuromonasalkenivoransz種，命名為DesulfuromonasalkenivoransS-7菌[14]。培養(yǎng)基基本組成如下:KH2PO4,0.5 g/L;NH4Cl,1.0 g/L;Na2SO4,0.5 g/L;60%乳酸鈉,4.0 g/L;CaCl2·2H2O,1.0 g/L;MgSO4·7H2O,2.0 g/L;酵母提取物1.0 g/L;重金屬廢水中金屬離子質(zhì)量濃度(Fe3+60 mg/L,Mn2+25 mg/L,Cr6+60 mg/L)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH=3.0±0.2。在接S-7菌入反應(yīng)器前，需對S-7菌株重復(fù)擴培3次以上保證SRB菌數(shù)量達到要求。

1.2 重金屬酸性廢水的生物處理

柱式反應(yīng)器裝置如圖1所示。該反應(yīng)器內(nèi)徑14.0 cm，高15.0 cm，有效容積2.0 L，反應(yīng)器在使用前需用3.0 mol/L HNO3浸泡72 h，并用去離子水進行漂洗。填充稻殼取自湖南某大米加工廠，將稻殼洗凈、晾干，滅菌置于105 ℃干燥后填充滿整個反應(yīng)器，從反應(yīng)器頂部充入高純氮(99.99%)，維持反應(yīng)體系前期的無氧狀態(tài)。試驗中采用恒流蠕動泵從反應(yīng)器頂部進重金屬廢水，通過循環(huán)水控溫(30±1) ℃。

圖1 柱式反應(yīng)器示意Fig.1 Schematic diagram of column reactor1—廢水儲存器;2—出水閥;3—恒流泵;4—入料閥;5—反應(yīng)器;6—夾套;7—噴淋頭;8—微生物加樣咀;9—取樣咀;10—濾膜；11—入池閥;12—出水閥；13—回水閥；14—循環(huán)恒溫水槽;15—回水閥;16—回收池出水閥;17—pH值檢測裝置;18—氧化還原點位Eh檢測裝置;19—電導(dǎo)率Ec檢測裝置;20—數(shù)據(jù)分析終端;21—廢水回收池

本試驗共設(shè)置2組試驗:一組為接種SRB微生物組，另一組為空白對照組(僅填充稻殼)，并設(shè)置3組平行試驗。試驗組添加培養(yǎng)至對數(shù)生長期的S-7菌，接種量為10%，空白組則只添加滅菌培養(yǎng)基，將填充滿稻殼的兩組反應(yīng)器通過蠕動泵加入2 L培養(yǎng)液，其中試驗組反應(yīng)器中SRB菌培養(yǎng)液30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。試驗組及空白組反應(yīng)器中分別持續(xù)添加含混合重金屬(Fe3+，Mn2+，Cr6+)合成廢水。合成廢水需每天在無菌條件下制備，并通入高純氮(99.99%)10 min驅(qū)除氧氣，然后通過恒流泵以100 mL/d的恒定流量從反應(yīng)器頂部連續(xù)泵入反應(yīng)器中處理。每天從反應(yīng)器底部取樣口取100 mL已處理的酸性廢水樣以維持SRB反應(yīng)器總體積不變，試驗組S-7菌液則通過流加法保證細菌濃度維持在同一數(shù)量級，盡量減少細胞濃度變化的影響。

1.3 樣品采集和分析

每天從試驗組與對照組中取5 mL樣品用于分析反應(yīng)器中處理液pH、氧化還原電位(Eh)、電導(dǎo)率(Ec)。每天取少量樣液10 000 rad/min離心分離后取上清液，用1 mol/L硝酸處理后(防止金屬沉淀或者吸附于細胞表面)采用原子吸收光譜(TAS-986，北京普析通用)測定淋溶液中3種代表性金屬離子(Fe，Mn和Cr)濃度。從處理20 d的SRB反應(yīng)器中取部分微生物組及空白對照組稻殼樣品，真空冷凍干燥8 h，研磨成粉末;并從反應(yīng)器中取酸性廢水處理液于4 000 rad/min離心2 min收集沉淀，取離心后的上清液于10 000 rad/min離心10 min收集細胞，將收集的沉淀、細胞經(jīng)真空冷凍干燥后，采用KBr壓片法制樣，用傅里葉紅外光譜儀(Nicolet Nexus 670,Thermo Electron,Waltham,Massachusetts)對樣品進行分析，測定光譜為4 000～400 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 S-7菌株和稻殼聯(lián)合處理重金屬廢水理化特性分析

SRB聯(lián)合稻殼處理酸性廢水的pH,Eh和Ec變化曲線如圖2所示。圖2(a)為pH變化曲線，整體上看試驗組SRB反應(yīng)器培養(yǎng)液pH比空白組pH高。試驗組酸性廢水經(jīng)處理前6 d其pH呈下降趨勢，可能是S-7正處于生長遲緩期，隨后pH整體呈上升趨勢，處理8～11 d反應(yīng)器中菌體進入對數(shù)生長期，pH上升較明顯，這與體系發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生了大量的溶解性硫化物例如H2S等，堿性條件下H2S起到中和作用，而酸性條件下H2S較容易從溶液中釋放出來導(dǎo)致pH緩慢上升有關(guān)[15]。在11～14 d，菌體進入穩(wěn)定期pH上升比較緩慢。在15～18 d 后pH基本維持穩(wěn)定在6.20左右，18 d后略有下降趨勢，這可能與S-7菌大部分處于衰退期或者SRB反應(yīng)器中H2S的濃度達到一定上限，H2S超過一定濃度對SRB反應(yīng)器中微生物有一定毒害作用[16]。研究表明pH值決定著游離H2S在總硫化物(HS-+H2S)中的比例，尤其當體系pH值<7.0時，游離H2S的含量較大，其對SRB有較強的抑制作用，使硫酸鹽的還原速率較慢[17]。試驗組盡管每天泵入SRB反應(yīng)器中的酸性合成廢水pH=3左右，但SRB反應(yīng)器中整體pH維持上升趨勢，且最終基本穩(wěn)定在6.20 左右，這表明S-7處理酸性廢水最大的優(yōu)勢在于可以提高廢水的pH。而空白組SRB反應(yīng)器處理的酸性廢水整體呈下降趨勢，主要原因是空白組SRB反應(yīng)器中每天泵入酸性廢水(pH=3.0左右)逐漸降低反應(yīng)器中pH。圖2(b)為SRB反應(yīng)器處理酸性廢水Eh的變化曲線，試驗組SRB反應(yīng)器中Eh在處理第1～11 d 整體呈下降趨勢，最高下降至-360 mV，表明試驗組SRB維持比較高的還原環(huán)境，有利于S-7菌的生長，且該階段Eh波動比較大;試驗組在處理后期(12～22 d)Eh基本維持穩(wěn)定。在試驗組SRB反應(yīng)器中1～11 d S-7細胞大量繁殖，由此可推測S-7菌株Eh值的波動是由細菌大量繁殖引起，越到后期(11～22 d)Eh波動越小，SRB菌株的還原能力越弱?？瞻捉MEh整體也維持在-200 mV左右，可能原因是反應(yīng)器通過聯(lián)合稻殼填充及通入N2維持反應(yīng)器的厭氧環(huán)境。反應(yīng)器中總離子濃度變化趨勢的Ec曲線變化如圖2(c)所示。試驗組Ec在SRB處理1～4 d 明顯升高，這與S-7菌在該階段處于延滯期處理效果不明顯基本一致。試驗組在5～9 d電導(dǎo)率下降明顯，而在11～22 d整體保持下降趨勢，基本可認為SRB反應(yīng)器中電導(dǎo)率的下降與S-7菌處理重金屬廢水使重金屬沉淀去除有關(guān)。

圖2 微生物組和空白對照組SRB反應(yīng)器中酸性廢水pH,Eh和Ec變化曲線Fig.2 Variation curves of pH,Eh and Ecin acid waste water in the SRB reactor of microbiome and sterile control group

2.2 S-7菌株和稻殼聯(lián)合處理重金屬廢水金屬離子變化

圖3為反應(yīng)器處理酸性廢水中Fe3+,Mn2+和Cr6+質(zhì)量濃度變化曲線。由圖3可知，微生物組和空白組淋溶液中3種金屬離子質(zhì)量濃度均有變化，其中Fe3+處理效果最為明顯，Mn2+次之，Cr6+變化最小。在處理前2 d，3種金屬離子含量整體呈上升趨勢，可知S-7菌的還原作用并不明顯。試驗組Fe3+質(zhì)量濃度經(jīng)S-7菌處理后最終質(zhì)量濃度在0.72 mg/L 左右，去除效果明顯(運行10 d，F(xiàn)e離子去除率達95%以上);Mn2+處理質(zhì)量濃度在5.20 mg/L左右(運行20 d，Mn2+去除率達79.2%)，而Cr離子經(jīng)處理最終質(zhì)量濃度在27.00 mg/L左右(其中Cr6+在運行前5 d，去除率達95%，后期Cr6+處理并不明顯)。對比試驗組與空白組金屬離子的變化，可知SRB反應(yīng)器中填充的稻殼對金屬離子有一定的吸附作用。由圖3(a)可知，F(xiàn)e3+在S-7菌處理前期(2～10 d)，其質(zhì)量濃度快速下降到0.50 mg/L左右，處理效果明顯，處理后期(11～20 d)SRB反應(yīng)器中Fe3+質(zhì)量濃度基本維持穩(wěn)定。空白組Fe3+質(zhì)量濃度隨進樣時間的增加整體呈上升趨勢。試驗組Mn2+質(zhì)量濃度變化趨勢與Fe3+質(zhì)量濃度變化趨勢基本一致，去除效果最佳時期為第2～10 d。對比試驗組與空白組Cr6+金屬質(zhì)量濃度，可基本判斷S-7菌株對Cr6+去除效果并不明顯。在處理第2～5 d，S-7菌株仍對Cr6+具有一定去除效果，但在處理第7～20 d SRB反應(yīng)器中Cr6+質(zhì)量濃度逐漸上升，基本與空白對照組中Cr6+質(zhì)量濃度相近。

圖3 微生物組和空白對照組SRB 反應(yīng)器酸性廢水Fe，Mn和Cr離子質(zhì)量濃度變化曲線Fig.3 Concentration variation curves of Fe,Mn and Cr in acid waste water in the column reactor of microbiome and blank control group

由圖3可知，前期廢水中離子的去除速率相較于后期較明顯，反應(yīng)器處理后期由于離子共存對廢水處理的影響使廢水中金屬離子質(zhì)量濃度趨于平衡，從而出現(xiàn)動態(tài)的制約平衡[18]。動態(tài)制約平衡條件下很難將金屬離子完全去除，因為當反應(yīng)器中累積的離子濃度分別降到制約平衡濃度下限時，就會阻礙金屬離子濃度繼續(xù)下降。因此本試驗金屬離子去除效果較好的時間為前5 d，而后期金屬離子去除效果并不明顯的原因可能是后期隨著金屬離子含量的增大，反應(yīng)器中金屬離子的累積濃度達到S-7菌株的致死濃度，從而減弱了菌株的還原能力。也有研究表明銅和鋅的兩者混合對微生物的毒性比單一重金屬的毒性更加顯著[19-20]，因此試驗中采用S-7菌株處理混合重金屬廢水，S-7菌株致死效應(yīng)可能比較明顯。由圖3(c)可知，該SRB反應(yīng)器對Cr6+的去除效果并不明顯，可能原因在多種重金屬離子存在條件下，S-7菌株處理金屬的機制不一樣，在Fe3+,Mn2+離子存在條件下，S-7菌株優(yōu)先處理Fe3+,Mn2+離子，或者高濃度Cr6+的毒性使S-7菌株對Cr6+離子處理效果本身并不明顯[21]。 SRB菌株處理含Cr6+的重金屬廢水時若體系中含有Fe2+離子對SRB的代謝有促進作用，可利用Fe2+和S2-生成FeS，然后利用FeS的強還原性還原Cr6+為Cr3+生成氫氧化物快速沉淀，同時生成的FeS沉淀既對微生物無毒性，又可以降低體系中硫化物的濃度從而減弱毒性[22]。也有可能反應(yīng)器中的理化特性(尤其是pH)，并不是處理Cr6+的最佳理化環(huán)境。同時根據(jù)目前的處理結(jié)果推測菌株S-7對3種離子的去除機制可能存在差異，有可能也存在離子共存效應(yīng)，其具體原因有待進一步研究。

2.3 S-7菌株和稻殼聯(lián)合處理重金屬廢水FT-IR光譜分析

反應(yīng)器處理酸性廢水實驗組及空白組中稻殼、細胞FT-IR圖譜如圖4所示。

圖4 實驗組及空白組SRB反應(yīng)器中稻殼及細胞FT-IR圖譜Fig.4 FT-IR atlas of rice husk and cell in SRB reactor of microbiome and blank control group

由圖4可知，實驗組及空白組稻殼兩者出峰的位置并沒有發(fā)生明顯變化。其中實驗組細胞在1 650 cm-1附近及實驗組稻殼在1 058 cm-1附近的波峰吸光度均略微高于空白組，可能是由于兩者之間存在不同官能團振動導(dǎo)致。由于稻殼及S-7細胞中許多官能團吸收帶對紅外圖譜都有貢獻，容易導(dǎo)致某一波數(shù)振動下發(fā)生譜峰疊加，因此很難確定吸收峰準確的出峰位置及其邊界。鑒于以上情況，實驗組和空白組的稻殼、細胞之間并沒有明顯的出峰變化，因此采用曲線擬合方法利用Peakfit軟件對已測的紅外光譜進行分峰擬合。根據(jù)圖4 FT-IR的紅外圖譜，現(xiàn)將實驗組及空白組的細胞、稻殼紅外光譜在波數(shù)400～1 800，2 800～4 000 cm-1進行分峰擬合，稻殼分峰擬合圖及細胞分峰擬合圖分別如圖5，6所示。

圖5 空白細胞(a，b)和試驗組細胞(c，d)在400～1 800和2 800～4 000 cm-1的FT-IR分峰結(jié)果Fig.5 Result points peak of FT-IR on 400～1 800 and 2 800～4 000 cm-1 of blank cells(a,b) and experimental cells(c,d)

圖6 空白對照組(a，b)和試驗組稻殼(c，d)在400～1 800和2 800～4 000 cm-1的FT-IR分峰結(jié)果Fig.6 Result points peak of FT-IR on 400-1 800 and 2 800-4 000 cm-1 of blank control group and experiment group rice husk

通過以上分析可以看出，S-7菌體處理重金屬廢水后，其表面吸附Fe,Mn,Cr離子后，羥基和胺基混合峰都增強，酰胺Ⅰ峰和酰胺Ⅱ峰都有略微的紅移現(xiàn)象，羧基也發(fā)生了紅移，說明在吸附這3種金屬離子時，羥基、胺基、酰胺基及羧基是發(fā)生吸附作用重要的官能團，但S-7對3種金屬離子的處理機制可能存在差異。

圖6為稻殼的紅外峰光譜，結(jié)合文獻[23-25]相應(yīng)波長處官能團的結(jié)果分析，原始稻殼在3 433 cm-1處出現(xiàn)的較寬吸收峰主要是由稻殼表面—OH和—NH2官能團的伸縮振動引起;2 902 cm-1處出現(xiàn)的峰是烷烴C—H的伸縮振動峰;1 650 cm-1處為羰基官能團的伸縮振動峰;1 520，1 460 cm-1吸收峰是芳香環(huán)烴類的不對稱彎曲振動峰。由于組成稻殼的主要成分是纖維素，并且其中含硅量一般較高，所以1 000～1 100 cm-1和800 cm-1處的吸收峰主要是由Si—O—Si反對稱和對稱伸縮振動引起[22,24]，推測1 010 cm-1處的吸收峰可能是SiO—CH3的反對稱伸縮振動引起。從試驗組和空白對照組稻殼的FT-IR及分峰結(jié)果可以看出，處理重金屬廢水前后，其紅外吸收整體譜線變化不大，其吸收峰變化較明顯位置主要集中在1 060 cm-1，1 650 cm-1處，說明稻殼的Si—O—Si和羰基在處理重金屬廢水中可能發(fā)揮了作用。

3 結(jié) 論

(1)利用S-7菌株處理酸性重金屬廢水，能夠明顯提高酸性廢水的pH。試驗組在SRB反應(yīng)器中每天持續(xù)添加pH 3.0的酸性廢水20 d，酸性廢水pH 最終穩(wěn)定在6.20左右。S-7菌株對3種代表性重金屬離子都有一定的處理效果，去除效率為Fe > Mn >Cr。

(2)S-7菌株在吸附這3種金屬離子時，羥基、胺基、酰胺基及羧基是發(fā)生吸附作用重要的官能團，但S-7對3種金屬離子的處理機制可能存在差異。同時稻殼的Si—O—Si和羰基在處理重金屬廢水中可能也發(fā)揮了作用。稻殼填充SRB反應(yīng)器不僅為S-7菌株生長提供厭氧及寄居環(huán)境，也對金屬離子去除存在一定程度的物理吸附作用。