王利明 李敬雙

摘要：為探討辣椒堿對小鼠脾淋巴細胞免疫功能的影響，試驗采取MTT法檢測辣椒堿對淋巴細胞增殖的影響，并采取ELISA法檢測辣椒堿對淋巴細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-6的影響。結(jié)果在一定的濃度范圍內(nèi)，辣椒堿能誘導(dǎo)淋巴細胞的增殖，促進細胞因TNF-α、IL-6的分泌，呈雙向調(diào)節(jié)。表明辣椒堿可通過刺激淋巴細胞增殖和促進分泌細胞因子分泌發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性。

關(guān)鍵詞：辣椒堿;淋巴細胞;細胞增殖;細胞因子

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.201 9.13.003

0 引言

辣椒堿（Capsaicin）又稱辣椒素，是辣椒中的主要呈辣物質(zhì);在自然界中主要存在于茄科植物辣椒及其變種的果實的胎座組織及果皮和籽中，是一種極其辛辣的香草酰胺類生物堿，純度特別高的辣椒堿呈白色片狀、針狀的結(jié)晶或粉末，其分子式為C18H227NO3[1]。有研究表明，辣椒堿具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抑菌[4]、促進脂肪代謝[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、調(diào)節(jié)胃腸道和心血管保護[7]等作用，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛使用。另外，辣椒堿在食品行業(yè)，生物農(nóng)藥行業(yè)、飼料領(lǐng)域[8]、保健品和食品添加劑工業(yè)等也以得到廣泛應(yīng)用，在免疫方面的研究較少。

試驗使用MTT法檢測辣椒堿對淋巴細胞增殖的影響，采用ELISA法檢測辣椒堿對淋巴細胞分泌的細胞因子的影響，探討辣椒堿的免疫調(diào)節(jié)活性，為辣椒堿在獸醫(yī)臨床及飼料添加劑行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

SPF級健康Balb/e小鼠購自錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 試驗藥物

辣椒堿購自成都曼斯特生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、臺盼藍和四甲基偶氮唑鹽（ MTT）購自美國GIBCO公司;PBS緩沖劑購自上海生物技術(shù)服務(wù)公司;新生牛血清購自四季青生物工程有限公司;IFN-γ和IL-6試劑盒購白武漢博士德公司;三羥甲基氨基甲烷（ tris）購自南通潤豐石油化工有限公司;DMSO購白Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細胞制備

把健康的BALB/C小鼠進行頸椎脫臼致死后，在無菌環(huán)境中剖開小鼠腹腔，摘除脾臟，將分離后的脾臟組織放于1個細胞篩中，將細胞篩放人裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿中。取1個無菌注射器，對其進行碾壓，然后收集細胞篩外的PBS.1400 r/min離心15 min，收集懸液，加入ACK LysisBuffer（紅細胞裂解液）放置5 min，1 400 r/min，離心15min，棄上清，重復(fù)2-3次。在5% CO2、37℃恒溫條件下，用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行細胞懸浮培養(yǎng)，收集懸浮細胞。隨后，用TrypanBlue染色鑒別，活細胞數(shù)要達到95%以上[9-10]。

1.2.2 淋巴細胞增殖檢測

在96孔細胞培養(yǎng)板中加入所收集到的淋巴細胞懸液，每孔加入100?μL，并設(shè)置空白對照組，濃度分別為25、50、75和100μg/mL辣椒堿的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，分別加入100?μL、放于37℃、5%C02的恒溫箱中培養(yǎng)44h，再分別加入20 μL MTT液，混勻，4h后，以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄去上清液;每孔再分別加入150 μLDMSO液，檢測酶標儀于570 nm處的OD值。運用公式刺激指數(shù)一藥物孔OD值/對照孔OD值，以此計算淋巴細胞的增殖效率[11]。

1.2.3 淋巴細胞分泌IFN-γ，和IL-6檢測

在24孔細胞培養(yǎng)板中加入收集到的淋巴細胞懸液，每孔1 mL，設(shè)置空白組、濃度分別為25、50、75和100μg/mL辣椒堿組RPMI-1640培養(yǎng)液，各加入1 mL。然后將培養(yǎng)板置于恒溫箱中培養(yǎng)48 h。離心，收集上清液，放在- 20℃環(huán)境中保存。按照ELISA試劑盒的說明書檢測細胞因子IFN-γ和IL-6含量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行一維方差統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，不同羅馬數(shù)字表示差異極顯著“P<0.01”。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒堿對脾淋巴細胞增殖的影響

不同濃度組的辣椒堿組與空白對照組相比較：不同濃度的辣椒堿組淋巴細胞的OD值均極顯著（P<0.01）高于空白對照組，說明辣椒堿可以有效刺激淋巴細胞的增殖。各濃度組之間比較：濃度為50μg/mL的辣椒堿組淋巴細胞的OD值都極顯著（P<0.01）高于其他質(zhì)量濃度組，說明濃度為50μg/mL時，辣椒堿對刺激淋巴細胞增殖的效果優(yōu)于其他濃度組，并且呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)。見圖1。

2.2 辣椒堿對脾淋巴細胞分泌細胞因子的影響

不同濃度組的辣椒堿組與空白對照組相比較：不同濃度的辣椒堿組分泌IFN-γ、IL-6的量均極顯著（P<0.01）高于空白對照組，說明辣椒堿可以有效刺激淋巴細胞因子IFN-γ、IL-6的分泌。各濃度組之間比較：濃度為50μg/mL的辣椒堿組淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-6的量均極顯著明顯高于其他濃度組，說明濃度為50μg/mL時辣椒堿對刺激淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-6的效果優(yōu)于其他濃度組，并且呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)。見圖2、圖3。

3 討論

淋巴細胞在免疫應(yīng)答過程中起核心作用。只有接受抗原刺激后才能分化增殖，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體或細胞因子，稱為免疫活性細胞[[12]。淋巴細胞增殖和細胞因子的分泌是評價細胞免疫功能的重要指標。白細胞介素是一類主要負責(zé)信號傳遞，聯(lián)絡(luò)白細胞群，調(diào)節(jié)細胞的活化、增殖和分化作用的細胞因子。IFN-γ又稱Ⅱ型干擾素或免疫干擾素，主要由T細胞、自然殺傷細胞等淋巴細胞分泌產(chǎn)生，可以誘導(dǎo)Thl型細胞的免疫應(yīng)答，具有免疫調(diào)節(jié)作用[13]。IL-6具有調(diào)節(jié)細胞生理功能，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)等多種生物學(xué)功能，還能增強IL-1對Th細胞的有絲分裂作用，促進T細胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體，IL-6主要免疫學(xué)功能是增強其他細胞因子的效果[14]。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，辣椒堿可以刺激淋巴細胞的增殖和細胞因子IFN-γ、IL-6的分泌，提示辣椒堿通過激活靜止的T細胞使其活化，增強淋巴細胞分化增殖，發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體或細胞因子。通過調(diào)節(jié)細胞免疫反應(yīng)與體液免疫反應(yīng)，進而發(fā)揮免疫增強的作用。

4 結(jié)論

辣椒堿可有效刺激脾淋巴細胞的增殖，能夠促進其分泌細胞因子IFN-γ、IL-6，從而，提高辣椒堿對小鼠淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)活性。

參考文獻

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基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金（ 20170540369）

作者簡介：王利明（1963-），男，碩士，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與獸醫(yī)免疫學(xué)。

通信作者：李敬雙（1963-），女，碩士，教授，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與獸醫(yī)免疫學(xué)。