張博霏

摘?要：研究了嗜熱四膜蟲BF5株?（Tetrahymena thermophila?BF5）種群在莠去津（Atrazine）脅迫下的整個(gè)變化過程，通過對不同濃度莠去津處理下的種群密度變化，種群自然增長差異，以及種群密度變化的時(shí)間差異，對莠去津的相對安全濃度尤其是其對水生原生動物四膜蟲的耐受濃度作初步研究。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下50ppb濃度莠去津已使四膜蟲種群無法進(jìn)入對數(shù)生長，100ppb濃度使種群受到嚴(yán)重?cái)_動，150ppb以上濃度使種群在48小時(shí)內(nèi)消亡。24小時(shí)半致死濃度為64.75ppb，96小時(shí)半致死濃度為39.10ppb。

關(guān)鍵詞：嗜熱四膜蟲BF5株;莠去津;種群密度

隨著生活水平的提高，人們對糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物需求日益增長，在土地自然產(chǎn)力有限，新的高產(chǎn)品種投入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)尚需時(shí)日的現(xiàn)狀下，增加包括除草劑在內(nèi)的各種農(nóng)業(yè)化學(xué)品的用量和使用頻度，成了目前的主要增產(chǎn)方式。然而，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的增產(chǎn)背后，是相當(dāng)沉重的生態(tài)代價(jià)，甚至直接或者間接地威脅到了人類自身的安全和健康。本實(shí)驗(yàn)所選取的研究藥品——莠去津?（Atrazine）?就是一種長期以來被認(rèn)為是低毒，甚至是對人類完全安全的除草劑產(chǎn)品，被長期并且廣泛地施用。其結(jié)果就是這種藥物在環(huán)境中的普遍存在，在土壤、水體和不少農(nóng)產(chǎn)品中均存在一定劑量的檢出。

1 莠去津（Atrazine）及其相關(guān)研究情況

1.1 莠去津介紹

莠去津是繼西瑪津之后1958年由瑞士嘉基公司開發(fā)的三嗪類除草劑，是旱地除草劑主要品種之一，在國內(nèi)外應(yīng)用比較廣泛。由于莠去津的優(yōu)良性能及價(jià)格優(yōu)勢，目前世界上很多國家普遍應(yīng)用，是國內(nèi)大量生產(chǎn)的除草劑品種之一。隨著我國除草劑需求量和使用量的增長，國內(nèi)莠去津原藥注冊生產(chǎn)企業(yè)達(dá)到20家以上，年產(chǎn)能超過6萬噸，已經(jīng)成為北方地區(qū)使用量最大的除草劑品種之一。

莠去津其他名稱有阿特拉津、草脫凈、Aatrex，Aktikon，Coyote和Gesaprim等，化學(xué)名稱為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

莠去津純品為白色粉末，由三聚氰酞氯與等當(dāng)量的乙胺和異丙胺在脫酸劑存在下作用得到。熔點(diǎn)175.80C，相對密度123，微溶于水，稍溶于有機(jī)溶劑。在中性、微酸性或微堿性介質(zhì)中穩(wěn)定，遇強(qiáng)堿和強(qiáng)酸易分解，土壤中DT?50?100天，水體中代謝時(shí)間與許多因素相關(guān)。另據(jù)USEPA的資料，其在水體中的DT?50?160天左右，溫度較低時(shí)所需時(shí)間更久。

1.2 有關(guān)莠去津毒性情況的研究

2003年4月加州大學(xué)伯克立分校的Tyrone Hayes等人的研究結(jié)果使得人們對莠去津等除草劑的使用安全性再次產(chǎn)生質(zhì)疑，相對3ppb的莠去津飲用水殘留標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中所使用的濃度要相對安全得多。在對非洲爪蛙（?Xenopus laevis?）的蝌蚪進(jìn)行了試驗(yàn)時(shí)，他們把處于發(fā)育階段的蝌蚪放到含有不同濃度的莠去津的水溶液中。當(dāng)莠去津的濃度達(dá)到0.1ppb時(shí)，雄性蝌蚪除了長出睪丸外，還長出了卵巢。而當(dāng)濃度達(dá)到1ppb時(shí)，雄蛙用來引吭求偶的喉管便無法正常發(fā)育，這注定使它們在成年后無法正常求偶。此外，研究人員把雄蛙置于含25ppb的莠去津水溶液中，它們的睪酮水平迅速下降。據(jù)此研究人員分析認(rèn)為，莠去津可能促使芳香族酶產(chǎn)物大量產(chǎn)生，結(jié)果把雄激素催化成了雌激素，從而使得雄蛙變成了雌蛙或不雄不雌的“陰陽蛙”。也就是說，對于實(shí)驗(yàn)中所涉及的兩棲類而言，莠去津可以作為一種環(huán)境激素來看待。

1.3 各國對莠去津使用及其殘留量的控制標(biāo)準(zhǔn)

鑒于莠去津的潛在的或已部分顯露的生態(tài)損害，在學(xué)界對莠去津的安全性問題存在一定程度的分歧的情況下，美國環(huán)保局（USEPA） 于2003年10月31日公布了莠去津臨時(shí)登記決議。加拿大病蟲害防治管理局（PMRA）依據(jù)美國環(huán)保局的報(bào)告建議削減莠去津的用量并于2004年1月1日起生效。歐盟國家則在同一時(shí)期或更早時(shí)間限制或完全禁止了莠去津的使用。

相對其他國家的控制力度，我國對于莠去津的控制顯得較為寬松，根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會（SAC） 2005年10月3日發(fā)布的G/SPS/N/CHN/88中規(guī)定莠去津在蘋果和梨中的最大殘留限量為200ppb，另在G/SPS/N/CHN/87中規(guī)定莠去津在農(nóng)田灌溉水的限量標(biāo)準(zhǔn)為150ppb。但在最新的生活飲用水國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5749-2005中規(guī)定莠去津殘留應(yīng)少于2ppb，甚至少于美國的3ppb標(biāo)準(zhǔn)，可見我國已開始關(guān)注其潛在的危害性。

2 四膜蟲介紹（材料與方法）

隸屬于原生動物門、寡膜綱、膜口目、四膜科、四膜蟲屬。已知有10余種。體長40～60微米，成倒卵形或梨形?？谖挥诟姑媲胺秸?，體表被以縱纖毛帶，口后纖毛帶一般為2條。胞肛和2個(gè)伸縮泡孔均位于細(xì)胞后端。無性生殖為橫分裂。有性生殖為接合生殖。合子核分裂分化產(chǎn)生新的大小核，兩細(xì)胞分開、分裂。

世界性分布，主要產(chǎn)自淡水，也有的生活于咸水或溫泉中。四膜蟲能在無菌的液體培養(yǎng)基中生長繁殖，長期以來用它為材料做了大量營養(yǎng)生長和藥物學(xué)方面的研究，是真核細(xì)胞基因工程研究的理想材料。

2.1 材料

2.1.1 嗜熱四膜蟲BF5株（?Tetrahymena.thermophila?BF5）

嗜熱四膜蟲BF5株（?T.thermophila?BF5）為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)純化后的四膜蟲品系，廣泛用于各種實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用四膜蟲經(jīng)實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)液1周以上培養(yǎng)，并保證其在實(shí)驗(yàn)所選用培養(yǎng)環(huán)境下可正常繁殖后予以使用。

2.1.2 莠去津藥液

本次實(shí)驗(yàn)所選用的原液為50%莠去津溶液，使用雙蒸水稀釋至10mg/L與1mg/L兩種濃度的實(shí)驗(yàn)用液密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 四膜蟲培養(yǎng)液

實(shí)驗(yàn)中可以供選擇的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基種類很多。主要有如下幾種：Singer氏培養(yǎng)液、Elliott氏培養(yǎng)液、（月示）胨培養(yǎng)液、沈錫祺等所用的有機(jī)培養(yǎng)液以及實(shí)驗(yàn)用四膜蟲的原培養(yǎng)液配方，另有固體培養(yǎng)基配方3個(gè)。

2.2 方法

2.2.1 相關(guān)儀器設(shè)備

使用的主要儀器設(shè)備如下：

OLYMPUS BH-2型?臺式光學(xué)顯微鏡

珠江 LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱?廣東省醫(yī)療器械廠

FA1004型??電子天平?上海天平儀器廠

YXQ602型?電熱式蒸汽消毒器?山東新華醫(yī)療器械廠

5-50μL、20-200μL、1-5mL移液槍?Therme Electron

200mL三角瓶、10mL及5mL試管、10mL帶蓋培養(yǎng)管、20及100mL量筒、試管架、各容量燒杯、超凈工作臺、2mL*24目細(xì)胞培養(yǎng)板、100目藻類計(jì)數(shù)板等

2.2.2 培養(yǎng)液的選擇和培養(yǎng)中理化指標(biāo)的控制

本次實(shí)驗(yàn)綜合考慮了手頭可使用的藥品、預(yù)實(shí)驗(yàn)中四膜蟲的生活情況以及培養(yǎng)液的保存情況，最終選用如下培養(yǎng)液作為菌種保存和實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)液。

培養(yǎng)遵循少量——多管獨(dú)立培養(yǎng)，統(tǒng)一時(shí)間轉(zhuǎn)接，正式實(shí)驗(yàn)前，菌種在選定培養(yǎng)液中經(jīng)至少一個(gè)完整的種群增長過程。培養(yǎng)溫度為26℃±1℃，無光照，PH 7.0左右，每12小時(shí)或更短間隔搖勻一次以保證培養(yǎng)液中溶解氧?？紤]到四膜蟲對氧的需求及較長的培養(yǎng)時(shí)間，擴(kuò)增初期采用10mL試管中加2-3mL培養(yǎng)液的少量多管并列培養(yǎng)的方式，這在一定程度上也可避免在初期種群密度較低時(shí)意外混入的雜菌對培養(yǎng)進(jìn)度的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 關(guān)于種群的觀察數(shù)據(jù)

于27 ℃恒溫培養(yǎng)6小時(shí)后開始觀察計(jì)數(shù)，經(jīng)過約186小時(shí) 16次觀察計(jì)數(shù)之后確認(rèn)實(shí)驗(yàn)組種群完全消失，期間數(shù)據(jù)見附表一。各梯度種群密度變化情況如下圖。由于150ppb以上濃度數(shù)據(jù)量較少，故不單獨(dú)繪圖。

3.2 關(guān)于個(gè)體差異的觀察數(shù)據(jù)

空白組和50ppb組在前期均存在核交換和結(jié)合生殖，空白組更是保持到了穩(wěn)定期之后仍有核交換，其他各組在實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)有性生殖現(xiàn)象。平均個(gè)體大小在各組中的差別并不明顯，但在同一管內(nèi)的個(gè)體中存在差別，分析為分裂生殖所致。同時(shí)，在較高濃度（≥150ppb）的組中以及在趨于衰退的管中，非規(guī)則形態(tài)的個(gè)體以及行動能力低下的個(gè)體明顯增多。

3.3 來自藥物因素的影響分析

其他的實(shí)驗(yàn)證明莠去津?qū)粑顒又饕蔷€粒體活性有抑制作用，考慮其為藥品抑制種群的主要因素。

3.4 來自非藥物因素的影響分析

其他因素如溫度PH等，特別是pH值和培養(yǎng)液內(nèi)溶解氧對四膜蟲種群的影響也是比較明顯的。實(shí)驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)，在pH值在5以下的培養(yǎng)液中種群難以生長，甚至在短時(shí)間內(nèi)消亡，當(dāng)pH在6.5-7.5的情況下，四膜蟲種群可正常生長。實(shí)驗(yàn)周期較長，又無法向管中補(bǔ)充氧氣，即使使用容積為10mL的培養(yǎng)管進(jìn)行5mL以下的培養(yǎng)并間隔一定時(shí)間晃動，當(dāng)種群密度上升到一點(diǎn)數(shù)量后，可用肉眼觀察到培養(yǎng)液上層接近液面處的密度要大于液體下層，可見其存在一定程度的缺氧。

4 結(jié)論

以上的分析和部分推斷，對于實(shí)驗(yàn)所用的四膜蟲菌株，50ppb或以下濃度才是安全的，100ppb是實(shí)驗(yàn)所用的四膜蟲菌株的耐受極限，超過該值的莠去津濃度會導(dǎo)致種群在48小時(shí)左右崩潰。即使莠去津?qū)Πㄈ祟愒趦?nèi)的溫血動物毒性不是相當(dāng)大，但是作為一種半衰期如此長的化學(xué)物質(zhì)，很難不考慮其慢性毒性和其他不被確定或未知的危害性。相對最新的飲用水標(biāo)準(zhǔn)的2ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)，水果（如蘋果、梨）中的200ppb，農(nóng)業(yè)灌溉用水的150ppb，乃至糧食作物（如玉米）中的50ppb標(biāo)準(zhǔn)都不算低，從保證食品安全的角度，以及突破農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的技術(shù)壁壘考慮，都有必要作出更嚴(yán)格的限定。

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