姚騏羽 羅 陽(yáng) 姚 煦 劉 軍

皮膚是人體最大的生物屏障，皮膚脂質(zhì)是皮膚重要的組成成分之一，在維護(hù)皮膚的屏障功能，防止透皮水丟失和外界環(huán)境物質(zhì)的侵入中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1]。表皮來(lái)源的脂質(zhì)主要由50%的神經(jīng)酰胺、25%的膽固醇、15%的游離脂肪酸以及少量的膽固醇酯和硫酸膽固醇組成[2]。亞油酸(linoleic acid，LA)是人類(lèi)表皮含量最多的脂肪酸，也是神經(jīng)酰胺的前體。亞油酸是一種不飽和脂肪酸，可以代謝為亞麻酸(γ-linolenic acid，GLA)，前列腺素(prostaglandin, PG)E1和花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，對(duì)于生長(zhǎng)、繁殖、皮膚功能都有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，亞油酸缺乏引起角蛋白K6、K16和K17增殖，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用生理脂質(zhì)可以提高滲透性屏障的穩(wěn)態(tài)并用于治療皮膚疾病。含LA和神經(jīng)酰胺的保濕劑對(duì)銀屑病的治療有一定的緩解作用[4]。含LA的乳劑均可顯著改善特應(yīng)性皮炎患者的屏障功能障礙[5]。此外，LA還可以抑制皮膚色素沉著，起到美白保濕的作用[6]。以上研究表明LA對(duì)維持表皮動(dòng)態(tài)平衡和角質(zhì)層滲透屏障起重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的蛋白包括絲聚合蛋白(Filaggrin，F(xiàn)LG)、角蛋白14(keratin 14，K14)、緊密連接蛋白(claudin-1)等。但目前并無(wú)LA對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞屏障相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)研究LA對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞屏障相關(guān)蛋白的作用機(jī)制，為進(jìn)一步預(yù)防和改善皮膚屏障功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 取5例包皮環(huán)切術(shù)后包皮置于含有青鏈霉素的PBS沖洗，去除皮下脂肪，將組織剪成小塊置于Dispase II酶中4℃消化過(guò)夜。第二天，用鑷子夾取表皮，將表皮從真皮上撕下來(lái)，表皮進(jìn)一步用含EDTA的0.25%胰酶37℃孵箱消化10 min，用完全培養(yǎng)基終止消化，70 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，制備單細(xì)胞懸液。取大約3×105放入25 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入KC-FSM培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen life公司)，置于37℃和5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)。每2～3天換液一次，傳代培養(yǎng)后第三代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)，倫理審批號(hào)2018快審第(KY001)號(hào)。

1.2 方法 LA配制：LA溶解于DMSO中，配成200 mg/mL的儲(chǔ)備液。-20℃冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)分組：將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，向細(xì)胞中加入不同濃度的LA溶液(終濃度分別為2、10、20 ng/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞提取RNA或者蛋白。

CCK8測(cè)定細(xì)胞活性：每孔加入10 μL CCK-8溶液(美國(guó)MedChem Express公司)，37℃孵箱培育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm處的吸光度。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和LA)；Ac：對(duì)照孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含LA)；Ab：空白孔吸光度(含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細(xì)胞、不含LA)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

qRT-PCR檢測(cè)：TRIZOL提取各實(shí)驗(yàn)組RNA，反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(南京諾唯贊生物科技有限公司)，具體：5× HiScript II qRT SuperMix 4 μL，總RNA 500 ng，RNase free H2O 補(bǔ)充到10 μL。反應(yīng)程序：50℃ 15 min，85℃ 5 s。PCR同樣按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA 1 μL，10 μmol上、下游引物各0.4 μL(引物見(jiàn)表1，引物序列來(lái)自Primer Bank)，SYBR Green Master 10 μL，雙蒸水8.2 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；循環(huán)反應(yīng)，95℃10 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。融解曲線(xiàn)：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。檢測(cè)儀器為ABI7300。結(jié)果用2-△△Ct表示，其中Ct為循環(huán)值?！鳌鰿t=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ctactin)-對(duì)照組(Ct目的基因- Ctactin)。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

Western blot檢測(cè):取上述各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，RIPA法提取蛋白。分別取50 μg各實(shí)驗(yàn)組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，小鼠抗人Filaggrin、兔抗人keratin-14、兔抗人claudin-1(美國(guó)Biolegend公司)(1∶1 000)和β-actin(1∶1000),4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗(1∶2000) 室溫孵育1 h，最后經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，成像儀內(nèi)成像，拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin的表達(dá)做內(nèi)參，用BandScan分析膠片灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)資料均以(均值±SD)表示。所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LA濃度與細(xì)胞活性的關(guān)系 LA濃度對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的生存率影響不明顯，與不加LA組相比，角質(zhì)形成細(xì)胞存活率隨LA濃度的增加而略微降低，當(dāng)LA濃度為20 ng/mL時(shí)，細(xì)胞可在24 h后仍維持在較高的生存率84.26%(圖1)。說(shuō)明LA對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞并未造成明顯損傷，但作用濃度也不宜太高。

*P<0.05;**P<0.01

2.2 qRT-PCR檢測(cè)LA對(duì)屏障相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響 應(yīng)用Real Time PCR檢測(cè)屏障相關(guān)蛋白mRNA水平，結(jié)果顯示與不加LA組相比，隨著LA濃度升高，F(xiàn)ilaggrin和keratin-14 mRNA表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，claudin-1的mRNA表達(dá)水平在10 ng/mL亞油酸作用下明顯升高，在20 ng/mL時(shí)表達(dá)下降，這可能與LA作用濃度高時(shí)，細(xì)胞存活率受影響有關(guān) (圖2)。

2.3 Western blot檢測(cè)LA對(duì)屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示(圖3a、3b)，在內(nèi)參β-actin表達(dá)基本一致的情況下，LA作用于角質(zhì)形成細(xì)胞24 h后可明顯上調(diào)Filaggrin和keratin-14的蛋白表達(dá)，且表現(xiàn)出明顯的梯度變化趨勢(shì)，與不加LA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而claudin-1蛋白的表達(dá)水平僅在LA 10 ng/mL時(shí)表達(dá)是增加的。

vs 0 ng/mL *,P<0.05;**,P<0.01

vs 0 ng/mL *,P<0.05;**,P<0.01

圖3亞油酸對(duì)皮膚屏障蛋白表達(dá)的影響

3 討論

亞油酸是皮膚必要的脂肪酸，通常由食物提供，但局部油脂涂抹可以滲入皮膚表層，以修復(fù)干性皮膚和由于表面活性劑而損傷的皮膚，提高脂肪酸水平，減弱皮膚深層的水分損失[7]。亞油酸有維持表皮屏障的作用，有研究表明痤瘡患者粉刺中亞油酸含量低于正常人，導(dǎo)致粉刺形成和表皮功能障礙，炎癥介質(zhì)滲透[8,9]。外用亞油酸可以減輕小鼠刺激性接觸性皮炎的癥狀[10]。此外，亞油酸還能促進(jìn)皮膚傷口的愈合[11]。目前亞油酸在保濕劑、藥物載體方面廣泛應(yīng)用，但對(duì)于具體的作用機(jī)制及濃度并不清楚。

完整的皮膚屏障是抵御外界不良因素侵?jǐn)_的第一道防線(xiàn)，其功能主要依靠角質(zhì)層形成。Filaggrin在維持皮膚上皮屏障功能中發(fā)揮重要作用。Filaggrin不僅是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，而且是天然保濕因子的主要來(lái)源[12]。角蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞主要的結(jié)構(gòu)蛋白，角蛋白keratin-14高表達(dá)是KC活化增殖的主要因素之一[13]。claudin-1是皮膚屏障功能的重要組成部分。Claudin蛋白具有多種生理功能，可以直接作用于緊密連接膜相關(guān)蛋白的鳥(niǎo)甘酸激酶同工酶，維持緊密連接特有的柵欄功能和屏障功能[14]。

我們的研究結(jié)果顯示，2 ng/mL和10 ng/mL亞油酸作用于角質(zhì)形成細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞生存率影響很微小，而20 ng/mL的亞油酸對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率較前兩個(gè)作用濃度明顯下降，因此應(yīng)用濃度不應(yīng)太高。對(duì)于皮膚屏障相關(guān)蛋白研究發(fā)現(xiàn)，隨著LA濃度升高，F(xiàn)ilaggrin、keratin-14的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上升，推測(cè)亞油酸能夠促進(jìn)皮膚屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞間的緊密連接，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖，保持角質(zhì)層含水量，維持皮膚屏障的完整性和緊密性，進(jìn)而起到保護(hù)和修復(fù)皮膚屏障的作用。

綜上所述，亞油酸可能對(duì)皮膚屏障有一定的保護(hù)作用，將亞油酸作用藥物載體或者添加到護(hù)膚品對(duì)改善皮膚有一定的作用，但作用濃度不宜太高。