吳其艷 吳亮亮 彭耀軍 賈興旺 劉天懿 顏光濤

(解放軍醫(yī)學(xué)院,北京 100853)

垂體瘤是腺垂體細(xì)胞引發(fā)的單克隆腫瘤，約占所有腦腫瘤的15%～20%，僅次于腦膜瘤及腦膠質(zhì)瘤[1,2]。雖然被認(rèn)為是良性腫瘤，但多達(dá)25%～55%的垂體瘤顯示出與惡性腫瘤相似的特征，如向周?chē)M織侵襲生長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度較快且尺寸較大，具有較高的復(fù)發(fā)率，對(duì)常規(guī)治療(包括放射治療)抵抗等，給患者生命健康造成極大威脅[3,4]。近期研究認(rèn)為，垂體瘤的侵襲行為和復(fù)發(fā)與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切[5]。T細(xì)胞和NK細(xì)胞是參與抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要免疫細(xì)胞，其抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生需要多種信號(hào)通路的參與，包括正性調(diào)節(jié)和負(fù)性調(diào)節(jié)通路。淋巴細(xì)胞活化基因3 (Lymphocyte-activation gene 3, LAG3)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要的免疫抑制受體之一,主要表達(dá)于活化的T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞表面，具有多種生物學(xué)功能[6,7]。越來(lái)越多的研究表明，有效抗腫瘤應(yīng)答的匱乏可能與LAG3的負(fù)性調(diào)控作用相關(guān)[8]。目前,尚未見(jiàn)有關(guān)垂體瘤患者外周血免疫細(xì)胞 LAG3 表達(dá)的報(bào)道。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)垂體瘤患者和健康志愿者外周血T細(xì)胞和 NK 細(xì)胞表面 LAG3的表達(dá)變化，初步探討垂體瘤的免疫抑制機(jī)制，為垂體瘤的診治尋找有效的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1資料 選取2017年至2018年解放軍總醫(yī)院神經(jīng)外科接受治療的30例垂體瘤患者，其中男15例，女15例，年齡52(25～72)歲。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診為垂體瘤，采血前均未接受手術(shù)、放療及化療等抗腫瘤治療，且排除自身免疫性疾病、急慢性感染及其他惡性腫瘤等。其中促性腺激素型垂體腺瘤14 例，混合型垂體腺瘤6 例，催乳素型垂體腺瘤4例，生長(zhǎng)激素型垂體腺瘤2 例，促腎上腺皮質(zhì)激素型垂體腺瘤2 例，無(wú)功能型垂體腺瘤2 例。選擇同期30例健康人為健康對(duì)照組，其中男15例，女15例，年齡50(22～65)歲，兩組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2試劑 鼠抗人CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PE-CY5、CD8-FITC、CD56-APC熒光素標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Beckman Coulter公司；鼠抗人LAG3-PE、IgG1-PE(同型對(duì)照)熒光素標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司；人外周血單核細(xì)胞分離液購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；采用BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2方法 收集垂體瘤患者及健康對(duì)照組靜脈血，用EDTA抗凝，采用密度梯度離心法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。PBMC樣本采用500 μl PBS 重懸，每個(gè)流式管加入50 μl 細(xì)胞懸液，每個(gè)樣本檢測(cè)均設(shè)置單陽(yáng)對(duì)照和同型對(duì)照，依次加入以下抗體各5 μl：①CD45-KO；②CD3-PC7；③CD4-PC5；④CD8-FITC；⑤CD56-APC；⑥IgG1 K-PE；⑦LAG3-PE；⑧CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PC5、CD8-FITC、CD56-APC、IgG1 K-PE；⑨ CD45-KO、CD3-PC7、CD4-PC5、CD8-FITC、CD56-APC、LAG3-PE；室溫避光孵育20 min，加1 ml PBS混勻終止反應(yīng)，2 000 r/min 離心3 min，重復(fù)洗2次后棄上清液，加入500 μl PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD3-CD56+NK 細(xì)胞的比例，及各細(xì)胞亞群LAG3分子的表達(dá)，采用Flowjo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1垂體瘤患者T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例的變化 流式細(xì)胞術(shù)選取外周血中CD45+的白細(xì)胞，檢測(cè)其中CD4+T、CD8+T和 NK 細(xì)胞的比例(圖1)。結(jié)果顯示，垂體瘤組 CD4+T 細(xì)胞比例較健康對(duì)照組顯著增高[(48.020±4.554)% vs (44.090±5.957)%，P=0.005 7]，如圖2A所示。垂體瘤組與健康對(duì)照組CD8+T細(xì)胞比例分別為 (22.720±6.835)%和(21.55±4.63)%，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.442 5)，如圖2B所示。垂體瘤組與健康對(duì)照組NK 細(xì)胞比例分別為 (7.937±3.137)% 和 (11.930±2.767)%，垂體瘤組 NK 細(xì)胞比例較健康對(duì)照者顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖2C。

2.2垂體瘤患者外周血T細(xì)胞和NK細(xì)胞LAG3的表達(dá) 分別選取外周血CD4+T、CD8+T和NK細(xì)胞，檢測(cè)其表面抑制性受體LAG3的表達(dá)(圖1)。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，垂體瘤患者外周血CD4+T細(xì)胞表面LAG3的表達(dá)顯著增高[(18.450±6.462)% 和 (11.610±9.364)%，P<0.01] (圖3A)；同樣，垂體瘤患者外周血CD8+T 細(xì)胞表面LAG3的表達(dá)顯著增高[(37.85±13.04)%和(18.04±11.76)%，P<0.001](圖3B)； 與此同時(shí)，垂體瘤患者外周血NK 細(xì)胞表面 LAG3的表達(dá)顯著增高[(32.94±13.8)% 和 (19.34±10.64)%，P<0.001](圖3C)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和 NK 細(xì)胞表面LAG3表達(dá)的流程圖Fig.1 Expression of LAG3 on CD4+T cells,CD8+T cells and NK cells

圖2 垂體瘤患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的比例Fig.2 Frequency of CD4+T cells (A),CD8+T cells (B) and NK cells (C) in patients with pituitary adenomasNote: HC.Healthy control group；PA.Pituitary adenomas group;Left panel.Representative flow cytometry results；Right panel.Summary graphs represent the frequency of indicated cells between the two groups.

圖3 垂體瘤患者外周血CD4+T、CD8+T和NK細(xì)胞表面LAG3的表達(dá)Fig.3 Expression of LAG3 on CD4+T cells (A),CD8+T cells (B) and NK cells (C) in patients with pituitary adenomasNote: HC.Healthy control group；PA.Pituitary adenomas group;Left panel.Representative flow cytometry results;Right panel.Summary graph represents the frequency of indicated cells between the two groups.

3 討論

垂體具有特殊的免疫特性，在解剖學(xué)上與大腦相連，卻不受血腦屏障的保護(hù)，因此能夠接受血源性免疫細(xì)胞的攻擊[9]。有研究指出，垂體瘤免疫微環(huán)境中具有不同程度炎癥免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[10,11]。輔助性 T 細(xì)胞，包括 Th1/Th2 和 Th17細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與垂體瘤的炎癥應(yīng)答；與此同時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的不同細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)和募集不同的免疫細(xì)胞亞群，共同參與垂體瘤的進(jìn)展[12]。本研究表明，垂體瘤患者外周血 CD4+T 細(xì)胞比例增高，然而具體機(jī)制尚不清楚，鑒于CD4+T細(xì)胞亞群的異質(zhì)性，仍需要進(jìn)一步明確各亞群細(xì)胞比例變化對(duì)垂體瘤患者免疫功能的影響。與大多數(shù)報(bào)道一致，研究中并未觀察到與健康組CD8+T細(xì)胞比例存在差異，可能仍需要擴(kuò)大樣本量或者進(jìn)一步細(xì)化細(xì)胞亞群后進(jìn)行研究。此外，垂體瘤患者NK細(xì)胞比例與健康組相比顯著降低，較低數(shù)量的NK細(xì)胞可能影響機(jī)體的免疫防御功能，使其無(wú)法發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[13]。

LAG3作為天然免疫和適應(yīng)性免疫的一種重要調(diào)節(jié)子，在腫瘤的免疫耐受中發(fā)揮著不容忽視的作用。LAG3的分子結(jié)構(gòu)與CD4相似，能夠以更強(qiáng)的親和力與MHCⅡ結(jié)合，抑制特異性CD4+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，從而限制CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答。多種腫瘤，如卵巢癌、腎癌、黑色素瘤和淋巴瘤等通過(guò)高表達(dá)LAG3介導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞的功能耗竭[14,15]。此外，LAG3在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面組成性表達(dá)，促進(jìn)其發(fā)揮免疫抑制功能[16]。Kotaskova等[17]發(fā)現(xiàn)，在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，高表達(dá) LAG3 預(yù)示了較差的預(yù)后。大量證據(jù)表明，LAG3 的功能與 PD-1 類(lèi)似，能夠抑制T細(xì)胞的過(guò)度活化和增殖，從而促進(jìn)腫瘤逃逸，而封閉LAG3 后，T 細(xì)胞耗竭狀態(tài)可被逆轉(zhuǎn)[18-21]。目前，已開(kāi)展多項(xiàng)臨床研究，評(píng)估阻斷LAG3與其經(jīng)典配體MHCⅡ結(jié)合所達(dá)到的抗腫瘤作用[6,22]。值得注意的是，LAG3能夠抑制CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，并不依賴(lài)于和MHCⅡ結(jié)合，提示可能有其他的機(jī)制共同參與LAG3介導(dǎo)的免疫抑制；研究其選擇性結(jié)合的配體及免疫學(xué)作用，或?qū)槊庖咧委熖峁┬碌乃悸穂23]。我們進(jìn)一步分析了外周血 CD4+T、CD8+T 和 NK 細(xì)胞表面 LAG3 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)垂體瘤患者外周血3種免疫細(xì)胞表面 LAG3 表達(dá)的陽(yáng)性率均顯著高于健康對(duì)照者，提示 LAG3 可能參與介導(dǎo)了垂體瘤患者的免疫耐受，在垂體瘤的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。下一步將繼續(xù)深入研究 LAG3 對(duì)垂體瘤患者免疫功能的影響和其作為腫瘤標(biāo)志物的可能性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)垂體瘤患者外周血 CD4+T 細(xì)胞比例增高，NK 細(xì)胞的比例顯著降低，而 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞表面 LAG3 的表達(dá)顯著增高，進(jìn)一步探究 LAG3 在垂體瘤中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制，或?qū)榇贵w瘤的診治提供新的靶點(diǎn)。