左婧馳，陳云，郭馨陽，桂琳，任天星，陳靜，卯玉嶸，袁發(fā)滸

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430056）

我國飲酒文化自古有之，因過度飲酒引發(fā)的疾病問題也伴隨而來，節(jié)假日期間急性酒精中毒案例更是屢見不鮮。急性酒精中毒往往導(dǎo)致患者胃腸道粘膜潰爛出血，加重肝臟代謝解毒負(fù)擔(dān)，親脂性乙醇甚至?xí)鹉X組織氧化損傷，危害極大[1-2]。因而，開發(fā)高效安全的抗醉解酒產(chǎn)品具有重要意義。

桃膠多糖（peach gum polysaccharide，PGP）是近年來被廣泛研究的一種天然來源多糖，其主要由阿拉伯糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等以β-糖苷鍵聚合而成[3]。以往研究表明PGP 具有良好的吸濕保濕性，同時具有良好的黏度和成膜性，具備良好的工業(yè)加工屬性[4-6]，此外，PGP 還具有降血糖、提高免疫力、改善腸道菌群等諸多優(yōu)良生物學(xué)特性，是保健食品開發(fā)的重要資源[7-10]。目前，尚未見將PGP 應(yīng)用于抗醉解酒方面的研究、開發(fā)。本研究通過體外、體內(nèi)試驗觀察PGP 抑制乙醇析出、保護(hù)胃腸道粘膜作用，同時進(jìn)一步研究PGP 與天然抗氧化劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）協(xié)同的抗醉解酒作用，并對其生物學(xué)機(jī)制做分析探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原桃膠（食品級）：香港位元堂藥廠有限公司；食用酒精（95%，食品級）：河南榮騰食品配料有限公司；透析袋（3 500 D）：北京索萊寶科技有限公司；乙醇檢測分析試劑盒：美國BioVision 公司；蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、一氧化氮（NO）檢測試劑盒、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）測試盒、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）測定試劑盒、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）活性測試盒：南京建成頂浩生物制技有限公司。

1.2 試驗動物

昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量22 g～25 g：湖北省疾病預(yù)防控制中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。小鼠飼養(yǎng)于溫度23 ℃～25 ℃、濕度40%～60%的SPF 級動物房內(nèi)，自由進(jìn)食飲水。所有動物實驗均于江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心內(nèi)完成，實驗經(jīng)江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)實施。

1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平（ME204E）：瑞士梅特勒-托利多；電熱恒溫水浴鍋（HH.S）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；光吸收全波長酶標(biāo)儀（SP-Max 2300A2）：上海閃譜生物科技有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（H1650R）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；紫外可見分光光度計（Evolution 300）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 PGP 對乙醇滲出的影響

以原桃膠為原料，采用徐燕等[3]所述方法提取制備桃膠多糖，即依次經(jīng)熱水浸提、乙醇沉淀、Sevage 去蛋白等工序后提取分離得到桃膠多糖。

以超純水溶解，分別配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%桃膠多糖溶液。用透析袋夾將透析袋一端夾住，加入10 mL 人工胃液，然后分別加入不同濃度的桃膠多糖溶液和生理鹽水，將其放入裝有250 mL 生理鹽水的廣口瓶中，0.5 h 后加入5 mL 食用乙醇于透析袋內(nèi)，隨即夾閉透析袋另外一端，將透析袋完全浸入廣口瓶內(nèi)生理鹽水中，用parafilm 封口膜封住瓶口，置于37 ℃培養(yǎng)箱中。采用劉佳[11]所述重鉻酸鉀酸性還原法，分別于試驗起始點 0、5、10、15、20、30、40、50、60、90 min 測定透析袋外溶液的乙醇濃度，以610 nm 處吸光度表示。

1.4.2 PGP 對急性酒精中毒小鼠的解酒作用

將雄性昆明小鼠分為6 組，每組8 只，試驗開始前8 h 禁水禁食，以0.5 mL/25 g 劑量分別給予生理鹽水0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%PGP 灌胃，0.5 h 后，再以0.4 mL/25 g 分別給予60%食用乙醇灌胃制備急性酒精中毒模型。試驗開始后，記錄小鼠翻正反射消失的時間為小鼠醉酒潛伏期時長，翻正反射消失至小鼠翻正反射再次恢復(fù)的時長為醉酒睡眠時間。

1.4.3 PGP 協(xié)同EGCG 對急性酒精中毒小鼠的血清乙醇含量的影響

與單獨使用PGP 觀察對小鼠急性酒精中毒模型試驗操作類似，分別設(shè)空白對照組、模型組、2%PGP預(yù)處理組、2 % PGP+100 mg/kg EGCG 預(yù)處理組、2 %PGP+200 mg/kg EGCG 預(yù)處理組、2 % PGP+400 mg/kg EGCG 預(yù)處理組，每組15 只小鼠，除對照組外以等體積生理鹽水灌胃外，其余各組在干預(yù)后0.5 h 后均0.4 mL/25 g 分別給予60%食用乙醇灌胃，分別于乙醇灌胃后0.5、1.0、1.5、2.0 h 采集小鼠眼眶靜脈血，分離血清，按BioVision 乙醇檢測試劑盒操作指南檢測血清乙醇含量。

1.4.4 PGP 協(xié)同EGCG 對急性酒精中毒小鼠的肝組織、胃組織生化指標(biāo)的影響

小鼠于乙醇灌胃2.5 h 后，采用頸椎脫臼法處死，解剖小鼠，分離出胃及肝臟，縱向剖開小鼠胃，生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，觀察小鼠胃腸粘膜損傷情況。按生化檢測試劑盒的使用說明分別檢測胃組織MDA 含量、NO 含量、PGE2 含量、SOD 活力及肝組織 ADH 活力、ALDH 活力。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用graphpad prism 6.0 軟件進(jìn)行分析處理，計量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGP濃度依賴性抑制體外乙醇滲出速率

以透析袋法體外模擬乙醇吸收試驗，分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的PGP 溶液預(yù)處理，與生理鹽水對照相比，各濃度PGP 預(yù)處理后，乙醇析出速率如圖1所示（以重鉻酸鉀酸性還原反應(yīng)液OD610nm表示[12]）。

圖1 不同濃度PGP 對體外模擬乙醇吸收的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PGP on simulated ethanol absorption in vitro

由圖1 可知乙醇析出速率均下降，且隨著PGP 濃度的增加，乙醇析出速度越慢。同時，可見空白對照組在試驗開始后乙醇析出線性增加，60 min 后乙醇析出基本完全，而PGP 處理后，乙醇析出速率僅于試驗開始30 min 內(nèi)呈現(xiàn)線性快速析出，而后析出速度明顯減緩，且隨著PGP 濃度的增加，最終析出的乙醇總量相應(yīng)減少。表明PGP 具有吸附乙醇分子，減緩乙醇滲出的作用。

2.2 PGP延長小鼠醉酒潛伏期、縮短醉酒后睡眠時長

不同濃度PGP 對小鼠醉酒潛伏期及酒后睡眠時長的影響如圖2 所示。

圖2 不同濃度PGP 對小鼠醉酒潛伏期及酒后睡眠時長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PGP on drunken latency and sleep length in mice

小鼠經(jīng)60%食用乙醇灌胃造模后，隨著灌胃PGP濃度的增加，可見小鼠醉酒潛伏期隨之延長（圖2A），濃度為1.5 %、2.0 %的PGP 處理組分別較空白對照（0 %PGP）的醉酒潛伏期時長顯著提高（P<0.01，P<0.001）。

醉酒后睡眠時間對比如圖2B 所示，可見1 %、1.5 %及2%的PGP 灌胃預(yù)處理后的小鼠均較空白對照小鼠的睡眠時間縮短且差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），隨著PGP 濃度的升高，相應(yīng)的睡眠時間逐漸縮短。

2.3 PGP協(xié)同EGCG顯著降低醉酒小鼠血清乙醇濃度

動態(tài)追蹤PGP 與EGCG 協(xié)同作用對醉酒小鼠血清中乙醇濃度的變化，如表1 所示。

小鼠血清乙醇濃度在灌胃酒精后，血清乙醇濃度先逐漸升高后下降。在2%PGP 單獨干預(yù)及2%PGP加不同濃度的EGCG 干預(yù)后，在監(jiān)測的0.5、1.0、1.5、2.0 h 這4 個節(jié)點，均分別較模型組小鼠的血清乙醇濃度下降，且隨著EGCG 濃度的增加，血清乙醇濃度降幅相應(yīng)增加。

表1 PGP 與EGCG 對醉酒小鼠血清乙醇濃度變化的影響Table 1 Effects of PGP and EGCG on serum alcohol concentration in drunken mice

2.4 PGP協(xié)同EGCG顯著緩解急性乙醇性胃粘膜損傷

解剖小鼠后，分離出小鼠胃，剖開后清洗去除胃內(nèi)容物后，小鼠胃粘膜組織形態(tài)如圖3 所示。

由圖3 可知，模型組小鼠胃粘膜組織整體充血紅脹，并有多處出血點及少量糜爛（圖3B）；2%PGP 預(yù)處理組小鼠胃粘膜組織充血顯著減輕，可見局部、分散的血管充盈紅脹（圖3C）；2 % PGP 與不同濃度EGCG 共同處理后，小鼠胃粘膜組織充血情況顯著改善，且隨著EGCG 濃度的增加，胃粘膜組織出血點隨之減少，2%PGP+400 mg/kg EGCG 處理組小鼠胃粘膜外觀與空白對照組接近，偶見零星點狀充血（圖3D～F）。

圖3 PGP 協(xié)同EGCG 對小鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of PGP combined with EGCG on gastric mucosal injury in mice

為進(jìn)一步深入分析PGP 與EGCG 對乙醇性小鼠胃粘膜損傷的保護(hù)作用[13-15]，檢測了胃組織的氧化損傷指標(biāo)MDA 含量及SOD 活力，如表2 所示。

模型組小鼠胃組織MDA 含量較空白對照組顯著增加、SOD 活力顯著下降，呈現(xiàn)明顯地氧化性損傷。而PGP 干預(yù)后，氧化損傷指標(biāo)得到明顯逆轉(zhuǎn)，且隨著EGCG 濃度的升高，逆轉(zhuǎn)程度相應(yīng)升高。

一氧化氮（NO）是胃組織重要的保護(hù)因子，胃粘膜損傷后NO 的合成增加并可抑制胃酸分泌，有利于胃粘膜損傷后的修復(fù)過程[14，16-18]。如表2 所示，小鼠灌胃后NO 水平顯著下降，經(jīng)PGP 或PGP 與不同濃度的EGCG 預(yù)處理后的小鼠NO 水平較模型組有顯著逆轉(zhuǎn)，且PGP 與EGCG 協(xié)同干預(yù)后，NO 水平較單獨使用PGP 的小鼠上升幅度增加（P<0.05）。同樣地，另一種胃組織保護(hù)因子，前列腺素E2（PGE2）[18-19]與呈現(xiàn)出與NO 一樣的變化趨勢，PGP 及EGCG 可顯著抑制因大劑量乙醇對胃組織損傷導(dǎo)致的PGE2 含量的損失。

2.5 PGP協(xié)同EGCG提高醉酒小鼠肝臟乙醇代謝酶活

肝臟是機(jī)體代謝乙醇最主要的器官（大于90 %），乙醇在肝內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶（ADH）催化后轉(zhuǎn)化為乙醛，再由乙醛脫氫酶（ALDH）催化轉(zhuǎn)為乙酸，而后進(jìn)一步分解并最終轉(zhuǎn)為二氧化碳和水。其中ADH 和ALDH是乙醇代謝最為關(guān)鍵的酶[20-22]，表3 所示為各組小鼠ADH、ALDH 活力變化情況。

由表3 可知，經(jīng)PGP 預(yù)處理后，小鼠肝臟ADH活力較模型組（6.78±0.51）U/mg pro 顯著增加（7.38±0.63）U/mg pro，P<0.05，且 EGCG 分別與 100、200、400 mg/kg EGCG 聯(lián)用后，ADH 活力均較單獨使用2%PGP 組小鼠升高，且2%PGP+400 mg/kg EGCG 組較單獨2 % PGP 組具有非常顯著統(tǒng)計學(xué)的差異（P＜0.01）。與ADH 變化趨勢一致，2%PGP 亦可增加小鼠ALDH 活力（504.45±30.31）U/mg pro，且 PGP 與不同濃度的EGCG 聯(lián)用后一樣地較單獨使用PGP 具有更高的ALDH 水平，呈劑量依賴性增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 PGP 與EGCG 對醉酒小鼠肝組織ADH 及ALDH 活力變化的影響Table 3 Effects of PGP and EGCG on ADH and ALDH activities in liver tissue of drinking mice

3 結(jié)論

本研究分別從體外試驗及動物實驗證實了桃膠多糖可吸附乙醇分子，抑制乙醇吸收入血，顯著延長急性醉酒小鼠的醉酒潛伏期，縮短小鼠醉酒后睡眠時間，具有良好的抗醉、解酒方面的應(yīng)用前景。此外，系統(tǒng)分析了桃膠多糖與天然抗氧化劑EGCG 聯(lián)用后對小鼠醉酒的影響，結(jié)果表明，桃膠多糖與EGCG 聯(lián)用可顯著增強(qiáng)桃膠多糖的抗醉、解酒方面的作用，其內(nèi)在機(jī)制包括：顯著減少乙醇所致胃組織氧化性損傷、增強(qiáng)胃組織清除氧自由基能力；增強(qiáng)胃黏膜屏障防御作用；提升肝內(nèi)乙醇代謝酶系的活力，促進(jìn)乙醇分解代謝。